Разработка научных основ создания технологии выделения и очистки генно-инженерных белков (1090305), страница 22
Текст из файла (страница 22)
Прецизионность, сходимость и правильность при определении содержаниямономера.Для изучения сходимости проводили по 8 определений содержания мономерарекомбинантного белка во фракциях, полученных в результате производственной очистки ионообменной хроматографией (готовили по 2 геля; нано-F129сили на каждый гель по 4 испытуемых образца) в течение трех рабочих дней.С использованием программы Microsoft Excel рассчитывали стандартное отклонение и относительное стандартное отклонение (коэффициент вариации).Максимальный коэффициент вариации составил 0,79 %, что не превышаетдопустимого предельного значения в 15 % (Таблица 15).Таблица 15.
Оценка сходимости при определении содержания мономера.Показатель,размерностьРезультаты определения на…суткиПервыеФракция №1Содержаниемономера РБ в%, среднеезначение76,56СтандартноеотклонениеКоэффициентвариации, %Вторые275,14177,57Третьи275,881276,7775,610,600,520,260,440,420,420,790,690,340,580,550,56Для изучения внутрилабораторной прецизионности по фактору «различныедни» дополнительно к выполненным при определении сходимости испытаниям проводили еще 3 анализа в разные дни.
Рассчитывали стандартное отклонение, относительное стандартное отклонение (коэффициент вариации).Полученные результаты приведены ниже (Таблица 16). Коэффициент вариации, определенный для испытаний, выполненных в различные дни, для двухфракций после ионообменной хроматографической очистки составил 0,60 %и 0,53 %. Оба значения не превышают 15 %, следовательно, метод можносчитать точным.Таблица 16. Определение внутрилабораторной прецизионности («разные дни»).Фракция №12Содержание мономера РБ в %, среднеезначение для испытаний, выполненных вразные дни76,6975,26F130Стандартное отклонение0,460,40Коэффициент вариации, %0,600,53Для изучения внутрилабораторной прецизионности по фактору «разные лаборанты» проводили определение содержания мономера рекомбинантногобелка в 3 испытаниях, состоящих из 4 определений разными исполнителями.Рассчитывали стандартное отклонение, относительное стандартное отклонение (коэффициент вариации).Представленные результаты также не превышают 15 % (коэффициент вариации для двух фракций составил 0,37 % и 0,24 %) (Таблица 17).Таблица 17.
Определение внутрилабораторной прецизионности («разные аналитики»).Фракция №12Содержание мономера РБ в %, среднеезначение для испытаний, выполненныхразными аналитиками76,4374,97Стандартное отклонение0,280,18Коэффициент вариации, %0,370,24Таким образом, для метода ПААГЭ в качестве определения молекулярноймассы мономера РП инсулина человека (подтверждения его подлинности) ианализе содержания его мономерной формы в производственных образцахбыла определена оптимальная нагрузка, составившая 0,5 мкг и 6 мкг белка на3 мкл трека соответственно.
Найден предел обнаружения: 0,1 мкг белка. Продемонстрировано, что содержание солей в образцах существенно не влияетна качество аналитической процедуры, и таким образом подтверждена устойчивость метода к изменению состава раствора образцов. Были оценены такиевалидационные характеристики, как сходимость, внутрилаборатрная прецизионность по факторам «различные дни» и «различные аналитики», правильность при соотнесении с методом масс-спектрометрии Maldi TOF-MS. Доказано, что метод ПААГЭ может быть использован в качестве метода контроляпроизводства РП.F1311.5. Очистка РП.Очистку гибридного предшественника проводили с помощью ионообменнойхроматографии на сорбенте ДЭАЭ-сефароза (Рисунок 52).FРисунок 33. Хроматографическая очистка рекомбинантного белка предшественника ИГ на ДЭАЭ-сефарозе (фракция 1 – целевой белок).
Синяя линия – УФ-детекция (mAu) процесса; зеленая – детекцияизменения состава (%) подвижных фаз; коричневая – детекция изменения проводимости (mS/См) подвижных фаз. Колонна Ø450 мм, объем 50 л. Подвижная фаза: 25 мМ трис в воде очищенной, рН 7,5,градиент хлорида натрия от 0 до 1 М.В результате предочистки с выходом 65±5 % был получен мономер гибридного предшественника с концентрацией 11±1 мг/мл и чистотой 85±7 % по данным внутрипроизводственного контроля (SEC и ПААГЭ: Рисунок 34, Рисунок 35).F132FРисунок 34.
SEC – хроматограмма очищенного РП: пик 4 –мономер РП; пики 2 и 3 – димерная и мультимерные формы РП (пик 1 ниже предела количественной оценки).FРисунок 35. Результат ренатурации белка: 1 – LMW калибровочный стандарт (массы, сверху вниз 94,72, 64, 45, 23, 14,5 кДа); 2 – очищенная фракция РП (целевой белок с молекулярной массой 17,5 кДа,остальные полосы – агрегатные примеси).F1331.6. Ферментативный гидролиз РП.Ферментативное расщепление РП с образованием инсулина протекает поддействием двух ферментов, трипсина и карбоксипептидазы В. Схематическипроцесс можно представить следующим образом (Рисунок 36).LysArg-GlySSSSArg-PheSSAsnGluArgArgThrКарбоксипептидаза ВТрипсинПрепроинсулинИнсулинGly 1Phe 1FS6S7SS720 21Asn11SS1930 ThrРисунок 36.
Схема ферментативного гидролиза РП.Рекомбинантный предшественник, имеющий молекулярный вес около17000 Да, гидролизуется с образованием инсулина (5808 Да). Трипсин, относящийся к классу сериновых протеаз, специфично расщепляет пептиднуюпоследовательность по остаткам основных аминокислот, в данном случае поостаткам аргинина. Карбоксипептидаза В отщепляет оставшиеся аминокислотные остатки (два аргинина) с С-конца В-цепи. В результате действия ферментов РП превращается в инсулин, лидерный фрагмент, С-пептид (без двухаргининов) и два остатка аргинина.При этом трипсин, отщепив в первую очередь вышеуказанные аминокислотные последовательности как наиболее стерически доступные, приступает кгидролизу инсулина в положении В31 по остатку лизина, отрезая остатоктреонина.
Так образуется дезтреонин (B30)-инсулина (дТИ).Отрицательное воздействие дТИ на организм человека не доказано. Тем неменее, дТИ является примесным пептидом в препаратах ГИЧ, и поэтому, со-F134гласно требованиям Фармакопеи, его содержание в сумме с другими родственными инсулину примесями не должно превышать 2 %. Однако физикохимические свойства инсулина и дТИ схожи, сходно и их хроматографическое поведение, что в значительной степени осложняет последующую очистку ГИЧ.Однако, если лизин (В29) обратимо модифицировать, то образование примесного дТИ можно было бы минимизировать.
Для этой цели предложеноиспользовать ангидриды различных дикарбоновых кислот, таких как цитраконовая, фталевая, малеиновая и янтарная [328, 329, 330, 331]. При этом‑‑‑‑предшественник инсулина перед проведением его ферментативного расщепления должен быть модифицирован посредством реакции ацилирования. Входе этой реакции аминогруппы, включая ε-аминогруппы лизина, приобретают отрицательный заряд, который мешает узнаванию трипсином (Рисунок37).OHNCHCH2COOOHNCOCCH3CH2CH2NH3FCOCH2CH2OCH2CH- H2OOCH2CH2HNCOCCH3OРисунок 37.
Модификация ε-аминогруппы лизина с помощью цитраконового ангидрида.После проведения ферментативного гидролиза предшественника с образованного инсулина снимают ацилированную защиту путем снижения значениярН раствора.Нами были детально изучены процессы блокирования и деблокированияостатков лизина в РП с помощью цитраконового ангидрида.
БлокированиеРП протекает достаточно быстро (в пределах 1 ч) в широком диапазоне температур (от 5 до 370С). Однако, при повышенных температурах (вышеF13520-220С) после внесения ферментов субстратный белок выпадает в осадок,что существенно ухудшает дальнейший процесс гидролиза. Поэтому блокирование проводили при комнатной температуре, а гидролиз - при 30-350С(при такой температуре гидролиз проходит за 3-5 ч). При этом количествоцитраконового ангидрида, необходимое для блокирования РП, варьировалосьв диапазоне от 0,1 до 2,0 г ангидрида/г РП. Определено, что наименьшее содержание дТИ и максимальный выход ГИЧ наблюдаются при использованииангидрида в концентрации 0,25-0,5 г/г (Рисунок 38).Выход ГИЧ, %28Содержание дТИ , %1,0260,8240,70,6220,50,4Выход ГИЧ, %Содержание дТИ, %0,9200,3180,20,0F0,51,01,52,02,5Количество цитраконового ангидрида, г/г РПРисунок 38.
Влияние цитраконового ангидрида на результаты гидролиза РП.Деблокирование проводили при комнатной температуре, подкисляя гидролизат до рН 3,0 соляной кислотой. Общее время деблокирования - 24 ч.В результате гидролиза РП, с предварительно модифицированным лизином(В29), и последующего снятия цитраконовой защиты с выходом около 83 %от теоретического был получен инсулин, содержащий менее 0,5 % дезтреонина, а также менее 2 % дезамидоинсулина. Однако содержание родственныхпримесей оказалось достаточно высоким, более 14 %.F136Таким образом, обратимая модификация остатков лизина в РП, действительно, способствовала существенному снижению образования побочного полипептида - дТИ.Полученный раствор-гидролизат был сконцентрирован в 10 раз с помощьютангенциальной фильтрации.
Концентрат очищали от примесей с помощьюОФ ВЭЖХ.1.7. Очистка ГИЧ и получение АФС.ГИЧ, полученный на стадии ферментативного гидролиза кроме целевого белка, обладающего биологической активностью, содержит ряд примесей, аименно: родственные примеси (недогидролизованный предшественник, А21дезаминоинсулин и проч.), бактериальные эндотоксины, остатки ДНК продуцента, высокомолекулярные полипептиды и т.д.
Для избавления от них быларазработана стадия основной очистки с помощью ОФ на силикагелеC8-15 мкм-20 нм (Рисунок 39).FРисунок 39. Хроматограмма ОФ ВЭЖХ-очистки ГИЧ (фракция 1 – целевой белок, фракция 2 – родственные примеси). Голубая линия – УФ-детекция (mAu) процесса; коричневая – количество этилового спирта в подвижной фазе (% об). Колонна Ø150 мм, объем 3,5 л. Подвижная фаза: 10 мМ лимоннаякислота в воде для инъекций, рН 2,3, градиент этилового спирта от 10 до 50 % об.F137Материал, элюированный с колонны в описанных выше условиях, фракционировали следующим образом: вторая фракция, содержащая 10-15 % продукта, не отвечала требованиям к чистоте инсулина и подвергалась вторичнойрехроматографической очистке; первая фракция, содержащая 80-90 % продукта, отвечала требованиям к чистоте инсулина и направлялась на финишную очистку (Рисунок 40).ИнсулинРодственныА21-епрдезамидимесиоинсулинИнсулина)ИнсулинА21дезамидоинсулинб)FА21дезамидоинсулинв)02.557.51012.51517.52022.5minРисунок 40.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
