Разработка научных основ создания технологии выделения и очистки генно-инженерных белков (1090305), страница 21
Текст из файла (страница 21)
Выбор оптимальной нагрузки при определении молекулярной массы мономера рекомбинантного препроинсулина.Задача выбора оптимальной нагрузки при определении молекулярной массысводилась к подбору такого количества наносимого на гель препарата, прикотором ширина и интенсивность получаемой белковой полосы сравнимы сшириной и интенсивностью полос стандарта LMW. При этом было необхо-F122димо учесть, что нагрузка стандарта определяется инструкцией по его применению.Как было упомянуто выше, образцы в данной серии экспериментов былиподвергнуты денатурации добавлением восстановителя ДТТ и кипячением.В лунки геля нагружали следующие количества белка (мкг в 3 мкл): 0,1; 0,15;0,25; 0,5; 0,75; 1,0; 1,5.Полоса белка, соответствующая нагрузке 0,5 мкг, наиболее сопоставима поширине и интенсивности с полосами белков стандарта LMW (Рисунок 29).LMW 0,1 0,15 0,25 0,50,75 1,01,5мкгLMW 0,1 0,15 0,25 0,50,75 1,01, 5а)Fмкгб)Рисунок 29.
Электрофореграмма образцов для выбора оптимальной нагрузки при определении содержания молекулярной массы РП (а и б - две серии образцов).3. Определение предела обнаружения рекомбинантного белка.Предел обнаружения представляет собой минимальное количество анализируемого вещества в образце, которое может быть обнаружено. Определяливизуально путем анализа препаратов с известным РП. Оценивали минимальное содержание, при котором анализируемое вещество надежно определялось.Для этого проводили две серии опытов со следующими нагрузками белка(мкг в 3 мкл): 0,01; 0,02; 0,05; 0,10.Пробы, содержащие 0,01 и 0,02 мкг белка оказались практически не определимы (Рисунок 30). Следовые количества предшественника проявлялисьF123лишь при нагрузке 0,05 мкг.
Надежно определялся 0,1 мкг. Поэтому именнотакая нагрузка белка на лунку была принята за предел обнаружения.0,010,02 0,05 0,1а)мкг0,010,020,050,1мкгб)FРисунок 30. Электрофореграммы образцов с различной нагрузкой для оценки предела обнаружениямономера РП (а и б-две серии образцов).4. Влияние содержания соли в образцах на качество аналитической процедуры (устойчивость метода, или robustness).Как было указано выше, в процессе производства РП подвергается очисткеионообменной хроматографией. Так как элюирование белка с хроматографической колонны проводят, градиентно повышая ионную силу подвижнойфазы (изменяя содержание хлорида натрия), то, очевидно, в образцах фракций очищенного белка, которые предполагается анализировать с помощьюПААГЭ, будет некоторое количество соли.
Наличие солей в образцах можетотрицательно сказаться как на концентрировании белков по мере прохождения по полиакриламидному гелю, так и на создании электрического поля (т.к.соли являются хорошими электролитами). Это может исказить результатыанализа. Часто на избыток соли в образцах указывает размытый характер переднего фронта и резкая граница задней полосы при вступлении белков вгель, т.е.
наблюдается картина, обратная нормальному поведению образцов вгеле.Для проведения сравнительных испытаний использовались три образца стандарта рекомбинантного препроинсулина (очищенного от примесных поли-F124пептидов), не подвергаемого денатурации, содержащие 0; 0,1 и 0,2 М хлориданатрия.Можно видеть, что на этапе концентрирования белка при вступлении в полиакриламидный гель для всех трех образцов наблюдалась резкая границапереднего фронта и размытая граница задней полосы (Рисунок 31). Следовательно, различное содержание соли в исследуемых образцах существенно неповлияло на качестве аналитической процедуры в целом.М NaCl: 00,1 0,2FРисунок 31. Электрофореграмма образцов с различным содержанием хлорида натрия (нагрузка 6 мкгбелка).5.
Прецизионность, сходимость и правильность при определении молекулярной массы белка.Точное определение молекулярной массы РП и его мультимерных примесей,образуемых в результате обратимой денатурации и последующей ренатурации в процессе производство, было проведено с помощью масс-спектрометрии. Для этого образец белка, полученного в результате денатурации/ренатурации (до хроматографической очистки) был проанализирован посредствомвысокоэффективной эксклюзионной хроматографии. Полученные при хроматографировании фракции оценивались с помощью метода электро возбуждения молекул вещества на поверхности мишени с последующей время-пролетной регистрацией молекулярных ионов ионизированных веществ (MaldiTOF-MS). В результате было продемонстрировано, что молекулярная массарекомбинантного препроинсулина составляет 17646 Да (Рисунок 32).
Приме-F125си составляют главным образом димеры (35328 Да) и тримеры препроинсулина (52979 Да).FРисунок 32. Определение молекулярных масс РП и его примесей (а - высокоэффективная жидкостнаяэксклюзионная хроматография, б,в - Maldi TOF-MS фракций после хроматографии).F126Для изучения сходимости проводили по 8 определений молекулярной массыдля фракции, полученной после ионообменной хроматографической очисткиРП, и по 6 определений для стандарта белка (готовили по 2 геля; наносили накаждый гель по 4 испытуемых образца фракции и по 3 испытуемых образцастандарта РП инсулина человека) в течение трех рабочих дней одним аналитиком.
С использованием программы Microsoft Excel 2002 рассчитывалистандартное отклонение и относительное стандартное отклонение (коэффициент вариации).Максимальный коэффициент вариации составил 0,68 %, что не превышаетдопустимого предельного значения в 15 % (Таблица 11).Таблица 11. Результаты оценки сходимости при определении молекулярной массы РП.П о ка з ат е л ь ,Результаты определения, на …суткиразмерностьОбразец, №С р е д н е езначениепервые1вторые21третьи212176631759517819178391777217835молекулярноймассы, ДаСтандартноеотклонение,731201095911551ДаКоэффициентвариации, %0,410,680,610,330,650,29* образец №1 - фракция белка, полученная в результате ионообменной хроматографической очистки; образец №2 - стандарт белка.Для изучения внутрилабораторной прецизионности по фактору «различныедни» дополнительно к выполненным при определении сходимости испытаниям проводили еще 2 анализа в разные дни.
Рассчитывали стандартное отклонение, относительное стандартное отклонение (коэффициент вариации).F127Полученные результаты приведены ниже (Таблица 12). Коэффициент вариации, определенный для испытаний, выполненных в различные дни, дляфракции после ионообменной хроматографической очистки составил 0,45 %,а для стандартного рекомбинантного белка - 0,64 %. Оба значения не превышают 15 %, следовательно, метод можно считать точным.Таблица 12. Определение внутрилабораторной прецизионности («разные дни»).Показатель, размерностьОбразец №1*2Молекулярная масса РБ в Да, среднеезначение для испытаний, выполненных вразные дни (5 дней)1772917759Стандартное отклонение, Да80114Коэффициент вариации, %0,450,64* образец №1 - фракция белка, полученная в результате ионообменной хроматографической очистки; образец №2 - стандарт белка.Для изучения внутрилабораторной прецизионности по фактору «разные лаборанты» проводили определение молекулярной массы рекомбинантногобелка в 2 испытаниях, состоящих из 4 определений молекулярной массы образца после хроматографической очистки и 3 определений молекулярноймассы стандарта разными исполнителями.
Рассчитывали стандартное отклонение, относительное стандартное отклонение (коэффициент вариации).Представленные ниже результаты также не превышают 15 % (коэффициентвариации для очищенной фракции составил 0,34 %, а для стандарта 0,93 %)(Таблица 13).Таблица 13.
Определение внутрилабораторной прецизионности («разные аналитики»).Показатель, размерностьМолекулярная масса РБ в Да, среднеезначение для испытаний, выполненныхразными аналитикамиОбразец №121769717714F128Стандартное отклонение, Да58165Коэффициент вариации, %0,340,93* образец №1 - фракция белка, полученная в результате ионообменной хроматографической очистки; образец №2 - стандарт белка.При изучении правильности использовали данные для определения сходимости и внутрилабораторной прецизионности по фактору «Различные дни».Сравнивали значение молекулярной массы, полученное электрофоретическим методом с величиной, определенной методом масс-спектрометрии.Результаты отлично коррелируют с масс-спектрометрическим анализом (Таблица 14). Следовательно, метод ПААГЭ можно считать правильным, такимобразом, метод можно обоснованно использовать в качестве подтверждениеподлинности РП.Таблица 14.
Оценка правильности метода ПААГЭ.Молекулярная масса, Да, определеннаяметодом ПААГЭметодом масс-спектрометрии(среднее значение)Maldi TOF-MSОбразец №1*Образец №2-177571778017646Ошибка определения, %**0,630,76-* образец №1 - фракция белка, полученная в результате ионообменной хроматографической очистки; образец №2 - стандарт белка.** рассчитывалось, как разница между показаниями ПААГЭ и Maldi TOF-MS, отнесеннаяк результату определения с помощью Maldi TOF-MS.6.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
