Разработка научных основ создания технологии выделения и очистки генно-инженерных белков (1090305), страница 24
Текст из файла (страница 24)
Полученный материал использовали для засева ферментераобъемом 1000 л. Ферментацию проводили до достижения культурой оптической плотности 15 ОЕ, индуцируя синтез гибридного белка 1-изопропил-β-D1-тиогалактопиранозидом. После окончания ферментации клетки штаммапродуцента гибридного белка (биомассу) отделяли центрифугированием, разрушая на дезинтеграторе Гаулина и выделяя центрифугированием тельцавключения. После окончания стадии ферментации отмытые от осколков клеточных стенок тельца включения солюбилизировали, используя сильные денатуранты (8 М мочевина, 25 мМ трис, 0,5 мМ ЭДТА, рН~10,0). Для разрываненативных дисульфидных связей между остатками цистеинов в белке в солюбилизирующий буфер вносили восстанавливающие агенты (10 мМ дитиотреитол).Контроль процесса проводили с помощью разработанной нами методики SEC(Рисунок 43): был получен образец с концентрацией 40±4 мг/мл и чистотой58±4 %.FРисунок 43.
SEC – хроматограмма денатурированного РП: пик 4 – восстановленный мономер РП,пики 1-3 – димерная и мультимерные формы РП.F1442.2. Рефолдинг РП.Рефолдинг растворенного белка инициируется удалением из солюбилизирующего буфера денатуранта и (в случае необходимости дальнейшего формирования дисульфидных связей восстанавливающего реагента.
Для этих целейприменяли несколько подходов: прямое разбавление и мембранная адсорбция.2.2.1. Ренатурация методом прямого разбавления.Раствор восстановленного белка постепенно вносили в буфер для ренатурации (25 мМ трис, 0,5 мМ ЭДТА), разбавляя в сорок раз. Полученный раствормы разделили на три части:- образец № 1 – проведение процесса ренатурации при нагревании реакционной массы (t=37˚C);- образец № 2 – проведение процесса ренатурации при комнатной температуре (t=23˚C);- образец № 3 – проведение процесса ренатурации при охлаждении (t=4˚C).Контроль за процессом осуществляли с помощью аналитической методикиSEC (Рисунок 44). Точное время остановки процесса выбиралось исходя изданных анализа.
Для остановки процесса рабочий раствор подкисляли раствором соляной кислоты до рН 7,5.F145FРисунок 44. SEC – хроматограмма ренатурированного РП: пик 5 – ренатурированный мономер РП;пик 4 – восстановленный мономер РП, пики 1-3 – димерная и мультимерные формы РП.Данные аналитического контроля сведены в таблицу (Таблица 19).Таблица 19. Сводные результаты проведения процесса ренатурации методом прямого разбавленияпри различных температурных режимах.Температурные параметры эксперимента, ˚С42337Время до окончания ренатурации, ч48204Содержание мономера, %857170,50,630,590,51Концентрация мономера, мг/млF146Из полученных данных можно сделать вывод, что максимальное количествобелка образуется при проведении процесса ренатурации при охлаждении(t=4˚С).
Однако это занимает больше времени, при повышении температурыуменьшается время проведения процесса, однако, также снижается чистотацелевого белка, что, в свою очередь, влечет за собой ухудшение степени разделения на стадии хроматографической очистки РП.Контроль процесса осуществляли также с помощью SDS-PAGE полученногорекомбинантного предшественника гларгина.1 2FРисунок 45. Результат ренатурации белка: 1 – LMW калибровочный стандарт (массы, сверху вниз 94,72, 64, 45, 23, 14,5 кДа); 2 – окончание ренатурации (целевой белок с молекулярной массой 17,5 кДа,остальные полосы – агрегатные примеси).2.2.2.
Ренатурация методом мембранной адсорбции.Для изучения метода адсорбционного рефолдинга мы использовали мембранные адсорберы производства компании Sartorius Stedim Biotech, Германия, любезно предоставленные доктором Ю.Новиковым (директор компанииСарторос, ООО).Проведение ренатурации белка на мембране, являющейся сильным анионообменником, с использованием трехфазной буферной системы продемонстрировано ниже (Рисунок 46).Предварительно мембрану уравновесили буферной системой (8 М мочевина,25 мМ трис, 10 мМ ДТТ), затем на мембрану нанесли восстановленный бе-F147лок, солюбилизированный в той же системе.
Процесс ренатурации обусловенснижением концентрации хаотропных и денатурирующих агентов. В нашемслучае необходимо было уменьшить концентрации мочевины и ДТТ, поэтомуна первом этапе мы градиентно избавлялись от данных реагентов для того,чтобы наш белок мог начать изменять третичную структуру, одновременнонаходясь в прикрепленном состоянии (негативный градиент концентрациимочевины и ДТТ).
После полного удаления мочевины из рабочей областимембраны, элюировали целевой белок путем градиентного увеличения ионной силы подвижной фазы. На последнем этапе была собрана фракция, которая, как мы предполагали, должна содержать целевой белок, однако анализпоказал, что в данной фракции содержатся только агрегаты.FРисунок 46. Хроматограмма проведения ренатурации с помощью мембранной хроматографии в трехбуферной системе.Проведение ренатурации в двухфазной буферной системе продемонстрировано ниже (Рисунок 47).F148Предварительно мембрану, также как и в предыдущем случае, уравновесилибуферной системой (8 М мочевина, 25 мМ трис, 10 мМ ДТТ), затем на мембрану нанесли восстановленный белок, солюбилизированный в той же системе. Главное отличие данного эксперимента от предыдущего заключалось втом, что с постепенным градиентным уменьшением концентрации мочевиныпроисходит увеличение ионной силы, позволяющее белку одновременноструктурно рефолдироваться и элюироваться в течение его движения по мембране.
Итогом эксперимента стали три собранные фракции. Ренатурированный белок в данном случае получен опять же не был, однако фракции 1 соответствует достаточно чистый восстановленный белок, фракции 2 и 3 – агрегатные примеси.FРисунок 47. Хроматограмма проведения ренатурации в двухфазной буферной системе с помощью мембранной хроматографии.Опираясь на полученные результаты, мы решили нанести на мембрану непосредственно солюбилизированные тела включения, и провести стадию восстановления непосредственно на мембране.
Данное решение было принятонами с целью уточнения причин агрегации целевого белка при элюции.F149Проведение стадии восстановления с помощью мембранной хроматографиипродемонстрировано ниже (Рисунок 48).В данном случае мембрану предварительно уравновесили буферной системойдля солюбилизации ТВ (8 М мочевина, 25 мМ трис), затем на мембрану нанесли расвторенные в той же системе тела включения.Для проведения процесса был выбран ступенчатый градиент:1 ступень: нанесение ТВ на мембрану;2 ступень: мембрану промывали фазой содержащей восстановитель (ДТТ);3 ступень: элюция целевого белка с мембраны в изократическом режиме спомощью повышения ионной силы.На третьем этапе была собрана одна фракция.
Было установлено, что в собранной фракции содеражится восстановленный белок (степень чистоты70 %), выход составил 90 %. Результат анализа полученной фракции представлен ниже (Рисунок 49).FРисунок 48. Хроматограмма проведения восстановления солюбилизарованного белка в трехфазнойбуферной системе с помощью мембранной хроматографии.F150FРисунок 49. SEC – хроматограмма ренатурированного РП: пик 4 – восстановленный мономер РП; пик5, целевой ренатурированный РП, ниже предела количественной оценки, пик 2 – тримерная форма РП(пики 1 и 3 также ниже предела количественной оценки).Проведение процесса ренатурации с помощью мембранной хроматографии вчетырехфазной системе продемонстрировано ниже (Рисунок 50).Благодаря результатам, полученным в предыдущем эксперименте, было решено попробовать провести ренатурацию РБ в четырехфазной системе. Дляэтого мембрану предварительно уравновесили буферной системой для солюбилизации ТВ, затем на мембрану нанесли растворенные в той же системетела включения.Для проведения процесса был также выбран ступенчатый градиент:1 ступень: нанесение ТВ на мембрану;2 ступень: мембрану промывали фазой содержащей восстановитель (ДТТ);3 ступень: вытеснение с мембраны мочевины и ДТТ ренатурирующим буфером;4 ступень: элюция целевого белка с мембраны в изократическом режиме спомощью повышения ионной силы буфера.На четвертом этапе была собрана одна фракция.
Было установлено, что в собранной фракции содеражится как восстановленный, так и ренатурированный белок (суммарный выход 30 %, степень чистоты целевого белка 27 %).Результат анализа полученной фракции представлен ниже (Рисунок 51).F151FРисунок 50. Хроматограмма проведения восстановления и ренатурации солюбилизарованного бекла вчетырехфазной буферной системе с помощью мембранной хроматографии.FРисунок 51. Результаты анализа процесса ренатурации по содержанию мономерной формы (пик 5 –ренатурированный мономер РП; пик 4 – восстановленный мономер РП; пики 1и 2 – тримерная имультимерная формы РП; пик 3 ниже предела количественной оценки).F152Анализируя полученные результаты, можно сказать, что количественныеданные, полученные при осуществлении ренатурации методом прямого разбавления, соотносимы с результатами проведения процесса с помощью мембранной хроматографии. Спектр примесей отличен: в случае прямого разбавления преобладают агрегативные примеси, особенно димеры и триммеры; вслучае мембранной адсорбции преобладает тримерная форма наряду с неренатурированным до конца восстановленным белком.Осуществление процесса с помощью мембранной хроматографии на данныймомент является перспективным направлением в области изучения процессовденатурации и ренатурации.
На данном этапе работы нами были подобраныоптимальные условия проведения процесса рентаурации, а также изученавозможность для применения мембранной хроматографии для осуществления процессов денатурации и ренатурации.2.3. Очистка РП.Очистку гибридного предшественника проводили с помощью ионообменнойхроматографии на сорбенте ДЭАЭ-сефароза (Рисунок 52).F153FРисунок 52. Хроматографическая очистка рекомбинантного белка предшественника ИГ на ДЭАЭ-сефарозе (фракция 1 – целевой белок, фракция 2 – высокомолекулярные примеси).
Голубая линия – УФдетекция (mAu) процесса; зеленая – детекция изменения состава (%) подвижных фаз; коричневая –детекция изменения проводимости (mS/См) подвижных фаз. Колонна Ø450 мм, объем 50 л. Подвижнаяфаза: 25 мМ трис в воде очищенной, рН 8,0, градиент хлорида натрия от 0 до 1 М.В результате предочистки с выходом 65±5 % был получен мономер гибридного предшественника с концентрацией 9±0,8 мг/мл и чистотой 85±7 % по данным внутрипроизводственного контроля (SDS-PAGE и SEC: Рисунок 53 и Рисунок 54).F154FРисунок 53.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
