Разработка научных основ создания технологии выделения и очистки генно-инженерных белков (1090305), страница 28
Текст из файла (страница 28)
Однако на производственном уровне разделений белковыхF183молекул все большее внимание уделяется мембранной хроматографии [342].‑Она обладает такими преимуществами перед классической колоночной хроматографией, как-то: большая производительность, обеспечиваемая за счетвысоких скоростей элюирования; простота валидации; отсутствие трудозатрат на упаковку колонны. Тем не менее, известной проблемой ионообменных мембран остается относительно низкая емкость связывания белков.Нами было проведено сравнительное изучение мембранной и классическойколоночной хроматографий применительно к предварительной очистке N,Nбисметионилгистона.
Для этого мы использовали отрицательно заряженнуюсульфопропильную сверхпористую мембрану, Sartobind S, и колонку, упакованную полиметакрилатным сорбентом с привитой сульфопропильной группой, Biopro S-75. Каждая из этих систем хорошо зарекомендовала себя нарынке товаров для биотехнологии и биофармацевтики и выпускается как дляаналитических, так и для производственных нужд. На каждую из тест-систем, предварительно уравновешенную подвижной фазой, содержащей10 мМ лимонной кислоты (рН 3,0), наносили раствор экстрагированного белка, рН в котором также был доведен до 3,0 с помощью 10 М NaOH.
Нанесение заканчивали, когда целевой белок начинал элюироваться без сорбции, т.е.когда все активные центры тест-системы были заняты молекулами белка.Было обнаружено, что динамическая емкость колонки, упакованной катионитом, составила 18,5 мг белка / мл адсорбента. В то же время емкость мембраны оказалась несколько ниже, 15,5 мг/мл. Ранее уже было показано, что скорость элюирования может достаточно сильно влиять на динамическую емкость адсорбента, особенно в случае колоночной хроматографии. Поэтомунами были проведены аналогичные опыты по определению динамическойемкости, но при различных скоростях нанесения. Действительно, как видноиз рисунка (Рисунок 72), динамическая емкость Biopro S-75 практически неизменна при скоростях ниже 200 см/час, а при дальнейшем увеличении скорости нанесения образца динамическая емкость начинала снижаться.
С другой стороны, при использовании мембран не было замечено явной зависимости динамической емкости от скорости потока. Стоит также отметить, чтоF184при скоростях выше 350 см/час давление в колонке Biopro S-75 превышалоустановленный передел в 3 бар (именно такое ограничение чаще всего устанавливается на производственных системах), делая невозможной дальнейшую работу, поэтому опыты при скоростях выше 350 см/час не проводились.Однако можно ожидать, что при сверхвысоких скоростях динамическая емкость сорбента будет ниже емкости мембраны.FРисунок 72. Сравнение динамической емкости катионообменных мембраны и сорбента при различных линейных скоростях потока.После нанесения образца обе тест-системы промывались подвижной фазой,содержащей 10 мМ лимонной кислоты (рН 3,0) и 2,0 М NaCl с тем, чтобы десорбировать целевой белок с одновременным концентрированием.
В обоихслучаях белок элюировался с высокими концентрацией (около 20 мг/мл, т.е.фактор концентрирования равен 8) и выходом (82-85%).F185Таким образом, мембранная хроматография БМГ является достаточно перспективной заменой классической колоночной хроматографии на производственном уровне.Для того, чтобы добиться еще и избавления от БЭ было решено элюироватьБМГ с колонны или мембраны в градиентном режиме вытесняющего агента.Традиционным вытесняющим агентом является хлорид натрия. При его использовании мы получали высокую селективность разделения, а белок элюировался при концентрации соли 0,8-1,0 М (Рисунок 73а).Однако необходимо отметить, что по результатам ЛАЛ-теста целевая фракция содержала БЭ более 300 ЕЭ/мг.
С тем, чтобы стимулировать агрегативные свойства ЛПС, нами было предложено проводить элюцию не хлоридомнатрия, а хлоридом кальция (Рисунок 73б). В результате было отмечено, чтоцелевой белок элюируется с меньшим удержанием (при 0,4-0,6 М хлоридакальция), при этом эффективность разделения от примесных компонентоввозрастает. Результаты ЛАЛ-теста подтвердили, что при использовании в качестве вытесняющего агента хлорида кальция БЭ снижаются эффективнее,до 80-160 ЕЭ/мг.Дальнейшим этапом оптимизации очистки рекомбинантного белка на ионообменном сорбенте было добавление в подвижные фазы детергентов. Детергенты, такие как тритон Х-100 могут в значительной степени улучшить показатели катионообменной очистки белков от БЭ.
В ходе эксперимента, однако,стало очевидно, что показатели очистки существенно не улучшаются при добавлении тритона Х-100 в подвижную фазу. В целевой фракции, по даннымЛАЛ-теста, содержание БЭ составило 150-300 ЕЭ/мг.F186FРисунок 73. Хроматографическая очистка рекомбинантного БМГ на сульфопропиловом сорбенте (пикс объемом удержания от 6 до 10 литров - БМГ). Голубая линия – УФ-детекция (mAu) процесса; зеленая– детекция изменения состава (М соли) подвижных фаз. Колонна Ø300 мм, объем 20 л. Подвижнаяфаза: 10 мМ лимонная кислота в воде очищенной, рН 2,3, градиент хлорида натрия от 0 до 2,5 М (а)или хлорида кальция от 0 до 1,25 М (б).Предположительно несоответствие полученных результатов литературнымданным связано с слишком сильным положительным зарядом на белке.
Вероятно, неионогенный детергент не может обеспечить ионных взаимодействиймежду белком и БЭ. Поэтому в эксперименте тритон Х-100 заменили наF187ионогенный детергент с сильным положительным зарядом, а именно на цетилтриметиламмоний бромид (ЦТАБ).
ЦТАБ может конкурентно связыватьБЭ, «оттаскивая» их от белка. Действительно, использование ЦТАБ позволило значительно снизить содержание БЭ в растворах БМГ. Содержание их вцелевой фракции составило 40-80 ЕЭ/мг. Выход стадии предочистки составил80±5 %.3.4. Основная очистка БМГ и получение АФС.Полученный высококонцентрированный БМГ должен быть очищен от рядапримесей, а именно: от родственных белков, остаточных белков (HCP, илиhost-cell proteins) штамм-продуцента, высокомолекулярных и низкомолекулярных примесей, БЭ, остаточной ДНК E.coli. При этом наибольшую трудность для очистки белков представляют примесные БЭ, наличие которых является неизбежным вследствие использования прокариотических систем экспрессии.В качестве основной очистки рекомбинантного белка мы решили использовать либо ВЭЖХ, либо ХГВ.
Мы тщательно изучили оба этих метода, протестировав коммерчески доступные сорбенты и подобрав подходящие условия.3.4.1. Хроматография гидрофобных взаимодействий как метод очистки БМГ.На связывании белка в результате взаимодействия между алифатической цепью адсорбента и соответствующим гидрофобным участком на поверхностибелка основаны методы гидрофобной хроматографии. Гидрофобную хроматографию можно распространить практически на все белки, поскольку гидрофобные взаимодействия усиливаются с повышение концентрации соли. Вчастности, соли, проявляющие наибольшую эффективность при высаливании, такие, как хлорид натрия, сульфат аммония характеризуются наибольшим усилением гидрофобных взаимодействий.ХГВ проводили с использованием сорбентов, основанных на полиэтиленоксиде Butyl-toyoperl и Hexyl-toyoperl.
Выбор был остановлен на данных сор-F188бентах в виду того, что их разработчики сообщают о высокой устойчивостисорбентов к крайним значениям кислотности среды, о высокой селективностисорбции, а также о том факте, что сорбенты этих видов в значительной мерелучше переносят высокие давления нежели, например, агарозные сорбентыфирмы Amersham Biosciences [343].‑В гидрофобной хроматографии могут использоваться сорбенты с различнымизаместителями. Из этого следует, что можно постоянно менять природу этихзаместителей, в тоже время все эти адсорбенты будут продолжать вести себясходным образом.Сначала проводили ряд экспериментов на коммерчески доступном сорбентеButyl-600M (Toyopearl). В подвижные фазы добавляли (NH4)2SO4 или NaCl.Разделение с использованием традиционных солей 1М (NH4)2SO4 и 1М NaClбыло очень плохим.
Сделали вывод о том, что концентрация стабилизирующего агента в элюентах мала. Для того, чтобы улучшить разделение, сталиувеличивать концентрацию соли в подвижных фазах. Белок отделился отпримесей на Butyl-600M с использованием 2М NаСl (Рисунок 74).Нагрузочная ёмкость сорбента составила всего 5 мг/мл (Таблица 24).
Разделение происходило только при высоких рН (pH 11) подвижных фаз. Такие условия процесса крайне неблагоприятны и могут привести к негативным результатамочистки, вследствие того, что pI БМГ довольно высокая и белок может легкоседиментировать в порах сорбента в во время очистки. Также условия проведения опыта неэкономичны и трудоёмки для препаративной очистки. Доведение рН подвижных фаз до таких высоких значений требует очень многощёлочи, так как из-за большого содержания соли, раствор сильно буферирует.F189FРисунок 74. Хроматографическая очистка рекомбинантного БМГ на Butyl 600M.
Голубая линия – УФдетекция (mAu) процесса; коричневая – детекция изменения состава (М соли) подвижных фаз. Колонна Ø26 мм, объем 40 мл. Подвижная фаза: 10 мМ трис в воде очищенной, рН 11,0, градиент хлориданатрия от 2 до 0,5 М.Таблица 24. Хроматографические результаты, включающие чистоту основной фракции белка, полученной в результате ХГВ на разных сорбентах.ПараметрButyl 600MHexyl 650CВыход, %6062Нагрузочная ёмкость, мг/мл56Чистота SDS-PAGE, %9090Чистота ВЭЖХ, %9898Содержание БЭ, ЕЭ/мг4-804-80Для того, что добиться лучших условий очистки белка, мы провели ряд опытов на другом коммерческом сорбенте Hexyl-650С (Toyopearl). Белок на нёмотделился при более мягких и благоприятных для него условиях (0,5-1,0 МNаСl, рН 3,0) (Рисунок 75). Однако нагрузочная ёмкость нового сорбента почти не отличилась от предыдущего и составила немного больше, 6 мг/мл(Таблица 24).F190FРисунок 75.
Хроматографическая очистка рекомбинантного БМГ на Hexyl 650C. Голубая линия – УФдетекция (mAu) процесса; коричневая – детекция изменения состава (М соли) подвижных фаз. Колонна Ø26 мм, объем 40 мл. Подвижная фаза: 10 мМ лимонная кислота в воде очищенной, рН 3,0, градиент хлорида натрия от 1 до 0 М.Можно резюмировать, что разделение с использованием ХГВ сорбентов наблюдалось, но было довольно плохим. Более того, выход целевой фракциибелка с чистотой 98 % составил лишь 60-65 %. Что касается результатовЛАЛ-теста, то их данные были далеки от нормативных требований и составили 4-80 ЕЭ/мг. Следовательно, такой вид хроматографии, в качестве основной очистки от БЭ, не подходит для производства рекомбинантного БМГ.3.4.2.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
