Разработка научных основ создания технологии выделения и очистки генно-инженерных белков (1090305), страница 29
Текст из файла (страница 29)
ВЭЖХ как метод очистки БМГ.В литературном обзоре были описаны различные методы очистки белков отБЭ. Среди наиболее распространенных следует указать двухфазную экстракцию липополисахаридов детергентами, ионообменную, обращено-фазовую иаффинную хроматографии, а также хроматографию гидрофобных взаимодействий. Однако только с помощью обращено-фазовой ВЭЖХ на аналитическом уровне нам удалось достичь максимально низкого содержания БЭ в субстанции N,N-бисметионилгистона.
Трудности, возникающие при очистке целевого рекомбинантного белка, по-видимому, связаны с сильным положительным зарядом молекулы, который обеспечивает крайне устойчивое взаимодействие с отрицательно заряженными липополисахаридами. Силикагель,используемый для обращено-фазовой хроматографии, всегда имеет какое-то,F191хоть и небольшое, количество силанольных групп, которые остались не привитыми ни липофильным углеводородным лигандом, ни агентом энд-кэппинга. Эти группы обладают отрицательным зарядом, и, возможно, константасвязывания N,N-бисметионилгистона с ними выше, чем константа связывания белка с эндотоксинами.
Этим может объясняться успех применения обращено-фазовой ВЭЖХ для очистки N,N-бисметионилгистона от БЭ, в товремя как остальные, достаточно признанные во всем мире методы не позволяют получить требуемой чистоты субстанции.Итак, в качестве основного метода очистки нами было решено использоватьОФ ВЭЖХ. Для этого мы также изучили различные типы коммерчески доступных сорбентов. Теоретически, для очистки белка с молекулярной массойоколо 22,5 кДа оптимальным выбором должны быть сорбенты с пористостью20-30 нм [344,345].
Мы решили протестировать следующие широко извест‑‑ные макропористые сорбенты для ВЭЖХ: Kromasil C4, 16 мкм, 30 нм; YMCButil (C4), 15 мкм, 30 нм; YMC Basic (C8), 15 мкм, 20 нм; YMC ODS-A (C18),15 мкм, 20 нм; CHP55A, 18 мкм, 25 нм. Как и в случае с катионообменнойхроматографией, изучение ВЭЖХ сорбентов мы начали с оценки динамической емкости. Для этого наносили раствор БМГ (с добавлением этанола до10 % об. с целью обеспечения смачиваемости частиц силикагеля) до тех пор,пока не начинался «проскок» вещества. Было определено, что емкость возрастает в ряду пористости 20-25-30 нм и достигает максимального значения,равного 200 г/л.
Необходимо отметить, что в ВЭЖХ (в отличие от ионообменной хроматографии) при такой нагрузке работать нецелесообразно, таккак разделение целевого и примесных веществ будет плохим. В препаративных масштабах рекомендуется нагружать на колонну не более 5-10 % от общей динамической емкости [346]. Поэтому в дальнейшей работе мы исполь‑зовали нагрузку 10 г/л.Далее мы провели сравнительное изучение сорбентов одного производителя(YMC Co, Германия), но имеющих липофильные лиганды разной длины с целью определить, какая «прививка» сорбента окажется оптимальной дляочистки БМГ. При использовании силикагеля С18 (YMC ODS-A) разделениеF192целевого и примесного компонентов с близким хроматографическим поведением протекало достаточно плохо (Рисунок 76а).
Разделение улучшилось, когда мы использовали сорбент с более коротким лигандом (С8 и С4); причем вслучае использование силикагеля с привитым остатком бутила разделениебыло наиболее высоким (Рисунок 76б, в).Таким образом, оптимальной неподвижной фазой для очистки N,N-бис-метионилгистона Н1.3 является ВЭЖХ сорбент с пористостью 30 нм и лигандомС4. Мы провели сравнительное изучение нескольких коммерчески доступныхсорбентов (Таблица 25). Наилучшим вариантом оказался Kromasil C4,16 мкм, 30 нм, который мы использовали далее во всех экспериментах.Таблица 25.
Сравнительная характеристика ВЭЖХ сорбентов, используемых для основной очисткиБМГ.СорбентKromasil C4 YMC ButilYMCBasicYMC ODS-A CHP55AТип матрицыСиликагельСиликагельСиликагельСиликагельПолистиролРазмер частиц,мкм1615151518Пористость, нм3030202025Динамическая200190180165175Выход, %7374686355Чистота(ВЭЖХ), %99,599,599,098,098,0емкость, г/лF193FРисунок 76. ВЭЖХ очистка БМГ на разных сорбентах: а – на силикагеле С18, б – на силикагеле С8, в –на силикагеле С4. Пик 1 соответствует БМГ, пики 2 и 3 – примесные белки.F194При оптимизации состава подвижной фазы мы столкнулись с тем, что хроматографическое поведение (точнее степень удержания) БМГ очень сильно зависит от рН используемых элюентов. Например, при использовании подвижных фаз с низким значением рН (ниже 4,0) белок десорбировался 10-20 %этанолом в составе элюента.
А при работе в высоких рН белок настолькосильно удерживался сорбентом, что приходилось повышать содержание этанола до 50 % и выше. При тщательном анализе этой особенности БМГ мыпришли к выводу, что зависимость степени удержания от рН подвижной фазыможет быть схематически представлена тремя зонами (Рисунок 77). Зона 1соответствует низким рН и слабому удержанию белка сорбентом. В этой зоневести процесс очистки кажется наиболее удобным, однако в рН ниже 3,0 концентрация этанола, необходимого для десорбции БМГ так мала, что белокможет не удерживаться должным образом при нанесении. Зона 2 – это зонанаиболее быстрого роста линии, описывающей зависимость графически.
Вэтой зоне слишком трудно добиться стабильной воспроизводимости результатов очистки, так как даже незначительное расхождение в значении рН подвижной фазы, приготовляемой для каждого конкретного цикла, может привести к существенным изменениям во временах удержания. В зоне 3, зоневысоких рН, также нецелесообразно вести процесс, в силу того, что при высоких концентрациях этилового спирта в элюенте белок может выпадать восадок.F195FРисунок 77.
Зависимость степени удержания БМГ от рН подвижной фазы.Для того чтобы минимизировать расход этилового спирта в дальнейшейочистке, а также для повышения селективности процесса нами было решенопроводить хроматографию в смешанном режиме, градиентно увеличиваяконцентрацию органического модификатора подвижной фазы, а также одновременно снижая значение рН.Мы провели скрининг различных кислот, которые могли бы добавлять в подвижную фазу, снижая содержание эндотоксинов в целевой фракции (Таблица 26).Очевидно, что целесообразно использовать только лимонную кислоту. Вовсех остальных случаях содержание эндотоксинов превышало нормативныетребования.Таблица 26.
Кислоты, добавляемые в подвижную фазу при ОФ ВЭЖХ очистке.F196КислотаГрадиент рНСодержание БЭв элюате, ЕЭ/млв целевой фракции, ЕЭ/мгЛимоннаяОт 4,0 до 2,1менее 0,060,06-0,48УксуснаяОт 3,5 до 2,0более 1,92более 1,92ФосфорнаяОт 3,8 до 1,9менее 0,060,96-1,92ТрифторуксуснаяОт 3,7 до 1,9менее 0,060,96-1,92СернаяОт 3,8 до 1,9менее 0,060,96-1,92МолочнаяОт 3,5 до 2,0более 1,92более 1,92ХлорнаяОт 3,7 до 2,0более 1,92более 1,92СолянаяОт 3,6 до 2,0более 1,92более 1,92Очевидно, что целесообразно использовать только лимонную кислоту. Вовсех остальных случаях содержание эндотоксинов превышало нормативныетребования.Таким образом, готовились две подвижные фазы: «А» состояла из 10 мМ лимонной кислоты и 20 % этанола (рН 4,0), «В» - из 10 мМ лимонной кислотыи 50 % этанола (рН 2,0).
Полученная в ходе очистки хроматограмма представлена ниже (Рисунок 78). Интересно, что пик основного вещества имеетвыраженное правое «плечо». По результатам SDS-PAGE, SEC и ВЭЖХ в основной фракции содержался БМГ с чистотой, близкой к 100 %, а в «хвостовой» фракции (правое «плечо» пика) – компоненты с молекулярными массами ниже 30 кДа (Рисунок 79).F197FРисунок 78. Хроматограмма ОФ ВЭЖХ-очистки БМГ. Голубая линия – УФ-детекция (mAu) процесса;зеленая – количество этилового спирта в подвижной фазе (% об). Колонна Ø100 мм, объем 3,5 л. Подвижная фаза: 10 мМ лимонная кислота в воде для инъекций, рН от 4,0 до 2,0, градиент этиловогоспирта от 10 до 50 % об.FРисунок 79.
Результаты анализа: а – SDS-PAGE (дорожка 1 – исходный материал; 2 – основная фракция; 3 – «хвостовая» фракция; 4 – стандарты масс LMW), б – ВЭЖХ основной фракции.По данным внутрипроизводственного контроля (SDS-PAGE и ВЭЖХ) чистота полученного после стадии основной очистки БМГ составила 98,7±0,5 %.Выход 77±6 %.F198После первого цикла ВЭЖХ-очистки содержание БЭ в целевой фракции белка было ниже 0,5 ЕЭ/мг, что удовлетворяет требованиям спецификации.
Однако после проведения нескольких циклов с использованием этой кислотыбыло замечено повышение уровня БЭ в целевой фракции, что, по-видимому,связано с «обогащением» неподвижной фазы сильно удерживающимисяЛПС. После проведения нескольких циклов, БЭ начинали вытесняться с сорбента, загрязняя продукт (Рисунок 80).Содержание БЭ в целевой фракции, ЕЭ/мг21,510,50123F45678FНомер цикла ОФ ВЭЖХ0,06F0,24F0,48F0,96F1,92FF0,061,92FF Максимально допустимое содержаниеF1,92Рисунок 80. Содержание БЭ в целевых фракциях белка, полученных с различных циклов ВЭЖХочистки.Очевидно, что получение воспроизводимых положительных результатовочистки можно достигнуть только при выполнении регулярной эффективнойдепирогенизации сорбента.3.4.3.
Депирогенизация ВЭЖХ-сорбента.F199Сначала для депирогенизации ВЭЖХ-сорбентов использовали температурную обработку (Таблица 27). Сорбент депирогенизировали при различныхтемпературах, подбирая оптимальные условия процесса. Проведя ряд опытов,получили, что после депирогенизации сорбента при температуре 200 °С в течение 2 часов, содержание БЭ в элюате соответствует нормативным значениям (< 0,03 ЕЭ/мл).Данный метод очень экономичен, однако довольно трудоёмок и занимаетмного времени в связи с тем, что нужно после каждого цикла переупаковывать колонку для того, чтобы извлечь сорбент, а затем упаковывать снова.
Всвязи с этими недостатками, в дальнейшем температурная обработка сорбента перестала использоваться в препаративной очистке на производстве.Таблица 27. Термическая депирогенизация ВЭЖХ-сорбента.Температура,°СВремя, чБЭ в целевой фракции, ЕЭ/мг1001>1,9215010,96-1,9215020,96-1,9220010,125-0,252002<0,03Производители ВЭЖХ-сорбентов рекомендуют проводить депирогенизациюлибо с использованием растворов 1-2М NaOH (50-70% об. органическогорастворителя в воде), либо с использованием 1-2М уксусной кислоты(50-70% об.
органического растворителя в воде). Однако, как было показановыше, экспериментальные результаты, полученные при использовании уксусной кислоты, противоречат последней рекомендации. А депирогенизациясильнощелочным раствором достаточно быстро гидролизует углеводородныйлиганд, привитый на силикагелевой матрице, приводя сорбент в негодность.Такую депирогенизацию нельзя проводить так часто, как требуется в случаеразрабатываемой технологии очистки БМГ.F200В ходе исследовательской работы, процессы депирогенизации проводили врастворе 70 % этилового спирта в воде для инъекций с добавлением буферных веществ, как указано ниже (Таблица 28). Подвижную фазу элюировали втечение двух колоночных объёмов, а затем переуравновешивали колонку (дваколоночных объёма) и отбирали пробу элюата для проведения анализа с помощью ЛАЛ-теста.Таблица 28. Химическая депирогенизация ВЭЖХ-сорбента.Вещество в фазеКонцентрация, МБЭ в элюате, ЕЭ/млNaOH0,3> 1,92NaOH0,5> 1,92NaOH1,0< 0,03NH0,3< 0,03NH0,5< 0,03Лимонная кислота0,1> 1,92Уксусная кислота2,0> 1,92Фосфорная кислот0,02< 0,03Трифторуксусная кислота0,02> 1,92Хлорная кислота0,02> 1,92Серная кислота0,08> 1,92Соляная кислота0,08> 1,92Жизнеспособность сорбентов, то есть их устойчивость к различным способам депирогенизации, изучали отдельно (Таблица 29).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
