Разработка научных основ создания технологии выделения и очистки генно-инженерных белков (1090305), страница 32
Текст из файла (страница 32)
Рядом с «цистиновым узлом» располагаются три β - шпильки,две из которых заканчиваются β- витками на одном конце молекулы (петлиαL1 и αL3), в то время как третья шпилька образует более открытую петлю(βL2) на противоположном конце (Рисунок 90) [352,,353].F217FРисунок 90. Пространственное строение субъединиц ФСГ.Гликозидный фрагмент ФСГ составлен остатками шести сахаров: фруктозы,галактозы, галактозамина, глюкозамина, маннозы и сиаловой кислоты. Двасайта связывания гликозидных остатков расположены в β- субъединице при 7и 24 остатках аспарагина, в α - субъединице при 52 и 78 остатках аспаргина.Строение углеводных участков гетеродимера является вариабельным, можетсуществовать в форме разветвленных цепей, которые завершаются остаткамисиаловой кислоты (Рисунок 91).F218FРисунок 91.
Структура боковых гликозидных цепей, связанных с α- и β-субъединицами в ФСГ человека.Причем, различие в содержании остатков сиаловой кислоты в молекуле ФСГиграет основную роль в определении времени жизни гетеродимера: болеекислые изоформы ФСГ (с большим содержанием остатков сиаловой кислотыв углеводном фрагменте) отличаются большим временем жизни и более высокой биологической активностью по сравнению с менее кислыми изоформами.
Это связано с тем, что менее кислые изоформы гетеродимера обладаютбольшей тропностью к асиалогликопротеиновым рецепторам плазматическоймембраны печени и почек, и, связываясь с ними, исключаются из циркуляциив организме человека. Различие в углеводной структуре ФСГ, и, прежде всего,в гормон - специфичной β-субъединице, определяет биологическую активность ФСГ и специфическое связывание с рецептором.5.1. Контроль метаболизма клеточной линииФСГ выделяли из культуральной жидкости, полученной в ходе промышленного культивирования продуцента СНО-К1. Режим культивирования - периодический с подпиткой. Для того чтобы точно определить фазу роста и фазубиосинтеза и начать выделение целевого продукта, нам оказался необходимметод контроля метаболизма культивируемой линии клеток.F219С этой целью нами был разработан метод хроматографического определениясодержания лактатов в культуральной жидкости СНО.Мы использовали коммерчески доступную хроматографическую колонкуTriart C 18 (YMC, Япония).
Выбор именно этой колонки был обусловлен тем,что, согласно данным производителя, неподвижная фаза обладает устойчивостью к высоким температурам и стабильностью в широком диапазоне рН.Кроме того, она упакована более мелким сорбентом (размер 3 мкм), что предполагает более высокое разделение.Описанные преимущества позволили нам использовать подвижные фазы снизким рН. На представленных хроматограммах видно влияние рН подвижной фазы на разделение. При рН подвижной фазы равной 2 молочная кислотапрактически неотделима от других компонентов.
Однако если уменьшить рНэлюента до 0,8 пик лактата можно анализировать (Рисунок 92).Такой метод анализа по-сути является офф-лайн методом, так как пробы анализируются post factum. Конечно, в производственном плане удобнее проводить он-лайн анализ лактатов с помощью специальных датчиков, встроенныхв биореактор. Стоит отметить, что цена таких датчиков на биофармацевтическом рынке пока остается очень высокой. Предложенный нами офф-лайн метод тем не менее очень мобилен и быстр: время анализа всего 7 минут, с учетом 6 минутной градиентной элюции и одноминутной подготовки колонки(уравновешивании).F220FРисунок 92. Влияние кислотности подвижной фазы на разделение при ОФ ВЭЖХ анализа содержаниямолочной кислоты в культуральной жидкости клеток СНО.
Условия анализа: скорость потока – 1мл/мин, температура 40оС, детекция 214 нм; подвижная фаза: ортофосфорная кислота для подведения рНв диапазоне от 0,8 до 2,0, ацетонитрил (в градиенте от 5 до 50 %). Стрелками показан пик молочнойкислоты.Данный метод позволил нам анализировать пробы из биореактора на протяжении нескольких дней культивирования продуцента и установить, что фазароста СНО-клеток в условиях биопроцесса занимает 6-7 дней, а фаза биосинтеза длится от седьмого до (ориентировочно) девятого дня (Рисунок 93).F221FРисунок 93.
ВЭЖХ-контроль метаболизма клеток СНО.5.2. Внешняя перфузия белковой фракции из культуральной жидкостиМы изучали различные методы выделения белка из культуральной жидкостипродуцента СНО. Среди них наиболее общеизвестным считается центрифугирование суспензии клеток в культуральной жидкости после остановки этапа культивирования. Нам этот метод показался не удобным по ряду причин:(1).
Он не технологичен и плохо масштабируется при переходе к биореакторам большего объема;(2). При высоких оборотах ротора центрифуги (выше 3000 об/мин) клеткиразрушаются, высвобождая в культуральную жидкость собственные белки,включающие протеазы;F222(3). Метод прерывен, а клетки не могут быть возвращены в биореактор длядальнейшего культивирования.Последняя причина является одной из наиболее важных, т.к., как видно из результатов контроля метаболизма с помощью описанного выше ВЭЖХ-метода,фаза роста клеток достаточно продолжительна, и использовать клетки единожды кажется нелогичным.Производителями современного оборудования для эукариотической экспрессии для решения проблемы отделения среды от клеток предлагается ряд перфузионных решений, самым известным из которых является внутренняя перфузия с помощью спин-фильтров.Как выяснилось, это решение может позволить в 1,5-2,5 раза продлить фазубиосинтеза, однако рано или поздно (как правило, все-таки раньше, чем хотелось бы) спин-фильтр забивается клетками, и процесс перфузии затормаживается.Другое решение, от инженеров компании Sartorius Stedim (Германия) - перфузионное устройство типа гидроциклон (354).
В гидроциклоне клетки разго‑няются под действием нагнетающей силы насоса (Рисунок 94). Конструкциягидроциклона такова, что исключает засорение гидроциклона. Однако, какмы выяснили в ходе экспериментальных исследований, гидроциклон в состоянии отделять частицы размером 5-10 мкм (размер клеток СНО) от жидкоститолько при скоростях выше 1000 мл/мин. При таких скоростях клетки не выживают и также при разрушении загрязняют жидкость протеолитическимиферментами.Не исключено, что гидроциклон может быть более эффективен в случае использования с другими типами клеток, например PER-C6.F223FРисунок 94. Конструкционная схема работы гидроциклона.Нами было предложено другое решение - применение внешней перфузии спомощью тангенциальных систем (Рисунок 95).С этой целью из биореактора откачивается с определенной (невысокой) скоростью суспензионная жидкость с помощью перистальтического или диафрагменного / мембранного насоса со сменной одноразовой головкой и подается на микрофильтрационный модуль.
Внутри модуля создается трансмембранное давление, достаточное для перфузии, но не достаточное для гибеликлеток (опытным путем определено, что такое трансмембранное давлениедля модуля с пределом отсечения 300 кДа должно составлять 35-55 мбар).Часть потока (ретентат), включающая клетки, возвращается обратно в биореактор; другая часть (пермеат), лишенная клеток, покидает систему биореактора и направляется на этапы «downstream» процесса.В качестве микрофильтрационных модулей мы исследовали кассеты с мембранами PES и полые волокна из керамики. Результаты перфузии и в том, и вдругом случае оказались практически идентичны: выживаемость клеток 98 %в день, производительность - около 2,4 объема биореактора в сутки с 1 м2площади микрофильтрационного модуля.F224FРисунок 95.
Внешнее перфузионное устройство эукариотической экспрессии.5.3. Вирусная инактивация и предочистка ФСГВсе операции по выделению и очистке белков проводились в условиях, исключающих окисление или денатурацию ФСГ. Такими условиями являлисьнизкая температуре (+5оС), при которой проводились этапы хроматографической очистки, контроль за рН, использование буферных растворов, содержащих вещества, препятствующие окислению р-ФСГ (нами использовался Lметионин в концентрициях 1-100 мМ).Полученный перфузиат разбавляли ВДИ в десять раз с целью снижения конечной проводимости раствора.F225Метод инактивации с помощью понижения рН считается достаточно эффективным в отношении многих вирусов и рекомеднован ВОЗ [355].
Мы устано‑вили, что молекула ФСГ достаточно устойчива и не денатурирует при рНвыше 2,5. Поэтому проводили инактивацию при рН 3,0.Удаление вирусов, как рекомендуется ВОЗ, должно проводиться либо методами нанофильтрации, либо хроматографически.Мы осуществляли кумулятивную вирусную инактивацию и удаление вирусов: хроматографически и понижением рН. Для этого образец наносили напредварительно уравновешенную подвижной фазой, содержащей 25 мМ трисв ВДИ (рН 7,3±0,2), колонну, упакованную ДЭАЭ-сефарозой, после чегоэлюировали белковую фракцию в изократическом режиме буферным раствором для вирусной инактивации, содержащим 10 мМ цитрата натрия, 150 мМхлорида натрия, рН 3,0. Элюат концентрированной белковой фракции выдерживали при указанном значении около 1 ч для полной вирусной инактивации, после чего разбавляли в десять раз буферным раствором 25 мМ трис,рН 6,5-8,0.
Полученный образец направляли на предочистку с помощью анионообменной хроматографии.В случае ФСГ, наиболее оправданно использование анионообменной хроматографии и буферных систем с рН 7. ФСГ будет заряжен отрицательно, тогдакак большинство примесных белков, несущие при таком рН положительнойзаряд, не будут сорбироваться неподвижной фазой и удаляться из образца настадии нанесения.Для этого наносили образец на предварительно уравновешенную колонну,упакованную ДЭАЭ-сефарозой.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
