Разработка научных основ создания технологии выделения и очистки генно-инженерных белков (1090305), страница 35
Текст из файла (страница 35)
ОборудованиеВ работе использовали:спектрофотометр с вариабельной длиной волны от 190 до 700 нм (Uvicord,США);рН-метр МР220 (Mettler Toledo, США);мешалка магнитная (VWR, Германия);система для фильтрации на базе перистальтического насоса (Waters, США);центрифуга до 10000 g (Heraeus Sepatech, Германия);система для тангенциальной фильтрации Pelicon (Millipore, США);система для тангенциальной фильтрации Biocon (Millipore, США).3.
Методы3.1. Контроль производства ГИЧ методом ВЭЖХВнутрипроизводственный контроль осуществляли с помощью градиентногоэлюирования через колонну для ВЭЖХ YMC-ODS-A, термостатированнуюпри 400С. Для этого использовали градиентную аналитическую системуF245Agilent 1200 (Agilent Technologies, США). Детектирование проводили при214 нм.Элюирование проводили со скоростью потока подвижной фазы 1,5 мл/мин.Подвижная фаза «А»: 10%-ый раствор ацетонитрила в воде, содержащий0,1 М сульфата натрия, 0,02 М ортофосфорной кислоты и 0,25 мл/л триэтаноламина. Подвижная фаза «В»: 50%-ый ацетонитрил в воде.
Для приготовления растворов использовали апирогенную воду. Растворы фильтровали подвакуумом через 0,22 мкм, затем дегазировали гелием в течение 5 мин.Элюирование проводили в градиенте фазы «В». Использовали следующуюпрограмму градиента концентрации подвижных фаз:Время элюции, минПодвижная фаза «Б», %0,020,05,020,012,750,013,0100,015,1100,018,220,023,520,0Время анализа 23,5 мин.3.2. Контроль производства ИГ методом UPLCВнутрипроизводственный контроль осуществляли с помощью градиентногоэлюирования через колонну для ВЭЖХ YMC-Hydrosphere, термостатированную при 400С. Для этого использовали градиентную аналитическую системуAgilent 1200 (Agilent Technologies, США).
Детектирование проводили при214 нм.Элюирование проводили со скоростью потока подвижной фазы 1,0 мл/мин.Подвижная фаза «А»: 10%-ый раствор ацетонитрила в воде, содержащийF2460,1 М сульфата натрия, 0,02 М ортофосфорной кислоты и 0,25 мл/л триэтаноламина. Подвижная фаза «В»: 50%-ый ацетонитрил в воде. Для приготовления растворов использовали апирогенную воду. Растворы фильтровали подвакуумом через 0,22 мкм, затем дегазировали гелием в течение 5 мин.Элюирование проводили в градиенте фазы «В». Использовали следующуюпрограмму градиента концентрации подвижных фаз:Время элюции, минПодвижная фаза «Б», %0,020,01,020,02,750,03,0100,03,1100,03,220,04,020,0Время анализа 4 мин.3.3. Контроль ГИЧ, ИГ, БМГ и Инт-Г методом SECС помощью SEC контролирование стадии ферментативного гидролиза,ВЭЖХ-очистки и гель-фильтрации.Внутрипроизводственный контроль ГИЧ осуществляли с помощью изократического элюирования через колонну YMC-DIOL, термостатированную при200С.
Для этого использовали изократическую аналитическую систему набазе насоса Applied Biosystems (Applied Biosystems, США). Детектированиепроводили при 280 нм.Элюирование проводили со скоростью потока подвижной фазы 0,5 мл/мин.Подвижная фаза: 15 % ацетонитрил в воде для инъекций, содержащий 15 %F247уксусную кислоту, 0,7 мг/мл L-аргинина. Растворы фильтровали под вакуумом через 0,22 мкм, затем дегазировали гелием в течение 5 мин.Время анализа 20 мин.Для определения специфичности во время валидации метода анализа в контрольный раствор были искусственно привнесены примеси:- в случае БМГ использовали низкомолекулярные примеси, полученные ферментативным расщеплением контрольного образца трипсином. К контрольному образцу БМГ с концентрацией 10 г/л добавляли 2 мл трипсина (концентрация трипсина 250 000 МЕ/мл) и перемешивали 2 ч на магнитной мешалкепри комнатной температуре.
Полученные в ходе трипсинолиза низкомолекулярные соединения искусственно добавляли в контрольные образцы БМГ.- в случае ИГ использовали 3 раствора очищенного РП с концентрациями6.00, 7.00 и 12.00 мг/мл. Три аликвоты этих растворов смещивали 1:1 с тремяаликвотами растворов, содержащих мультимерные формы РБ в концентрации2.14, 3.12 и 4.26 мг/мл. Полученные растворы с различными концентрациямиренатурированного мономера РБ 3.00, 4.50 и 6.00 мг/мл анализировали в течение одного дня в пяти повторах.3.4.
Контроль производства БМГ методом ОФ ВЭЖХВнутрипроизводственный контроль осуществляли с помощью градиентногоэлюирования через колонну для ВЭЖХ YMC-ODS-A, термостатированнуюпри 400С. Для этого использовали градиентную аналитическую системуAgilent 1200 (Agilent Technologies, США). Детектирование проводили при214 нм.Для определения содержания БМГ методом ОФ ВЭЖХ использовали подвижные фазы на основе буферного раствора (0,16М сульфата натрия, 0,2%фосфорной кислоты, 0,02% об. триэтаноламина, pH 2,5) и ацетонитрила.Элюция проводилась с расходом подвижной фазы 0,6 мл/мин в режиме градиента с использованием подвижных фаз А (10% об. ацетонитрила) и В (50%F248об.
ацетонитрила); подвижные фазы дегазировали гелием в течение 5 мин.Детектировали при длине волны 214 нм; температура колонки 400С, температура образца комнатная; время анализа 14 мин. Использовали следующуюпрограмму градиента концентрации подвижных фазВремя элюции, минПодвижная фаза «Б», %0,0707,0309,0011,0011,17014,070Время анализа 14 мин.Для определения специфичности во время валидации метода анализа в контрольный раствор были искусственно привнесены примеси: использоваликультуральную жидкость неиндуцированной клеточной культуры E. coli, несодержащую целевой белок. Для получения примесной добавки в процессекультивирования штама-продуцента E. coli Bl21(DE3)/pEGT1/H1.3S до добавления индуктора было отобрано 5 л неиндуцированной клеточной культуры.Последующая гомогенизация (гомогенизатор APV-1000, APV Gaulin, Голландия), центрифугирование (скорость 7 000 об/мин, время центрифугирования10 мин, центрифуга Heraeus Sepatech, США), а также экстракция 2,5 % перхлорной кислотой позволили получить культуральную жидкость, не содержащую целевой гистон, но обладающую полным спектром характерных примесей белковой природы.F2493.5.
SDS-PAGEПроводили согласно методу Леммли [357]. Окрашивание проводили при по‑мощи Coomassie Brilliant Blue R-250 (Bio-Rad, США).3.6. Контроль лактатов методом ВЭЖХАнализ динамики роста клеток СНО (huFSH/IK, получена из клеточной линии CHO K1 DXB11 (dhfr-)) проводили на хроматографической системеAgilent 1200 (Agilent Technologies, США), снабженной хроматографическойколонкой YMC Triart C18 3 мкм, 150 x 4,6мм (YMC, Германия), УФ детектором (длина волны 214 нм) и системой дозированного ввода пробы (объемпробы 20 мкл). Подвижная фаза «А» состояла из 10% ортофосфорной кислоты, воды для инъекций (рН 0,8), фаза «В» состояла из 50% ацетонитрила,воды для инъекций.
Элюирование проводили в режиме градиента концентрации ацетонитрила (от 0 до 50 % об.). Скорость потока 1 мл/мин. Время анализа 12 мин.3.7. Масс-спектрометрия ИГПроводили на приборе Bruker Daltonics (США), в лаборатории инструментальных методов анализа ИБХ РАН. Метод: MALDI-TOF.3.8. Пептидное картирование ИГОпыты проводили на хроматографической системе Agilent 1100.Хроматографировали на колонке Phenomenex Luna.Контрольный образец белка после очистки, образец препарата«Лантус» (Sanofi, France).Приготовление сульфатного буфера, рH 2.0264 г сульфата аммония (осч) помещают в мерную колбу вместимостью 1000мл и растворяют в воде очищенной (для ВЭЖХ). Затем готовят 1000 мл раствора 0,5 М кислоты серной (хч). Приготовленные растворы смешивают вF250равных объемах, рН полученного раствора равен 2,0 (контролируют потенциометрически).
Затем смесь фильтруют смесь через мембранный фильтр сдиаметром пор 0,45 мкм.Приготовление подвижной фазы «А».Смешивают 100 мл ацетонитрила, 700 мл воды для ВЭЖХ и 200 мл сульфатного буферного раствора с рН 2,0 и дегазируют гелием в течение 5 мин.Приготовление подвижной фазы «В».Смешивают 400 мл ацетонитрила, 400 мл воды для ВЭЖХ и 200 мл сульфатного буферного раствора с рН 2,0 и дегазируют гелием в течение 5 мин.Метод ВЭЖХ анализа образцов после гидролизаАнализ проводили при t=40C˚. Скорость потока подвижной фазы 1,0 мл/мин.Время анализа 80 минут.Градиент:ВремяПроцентное содержание фазы«А»090590601065070070,1908090Исследование проводилось по методу пептидного картирования продуктовферментативного гидролиза испытуемого образца протеазой изStaphylococcus aureus, (штамм V-8 эндопротеиназа Glu-C, ЕС 3.4.21.19, Сигма, Р2922) в сравнении с образцом стандарта инсулин-гларгина («Лантус»),обработанного аналогичным способом.
Навески испытуемого и стандартногообразцов инсулин гларгин растворили в 300 мкл трис-HCl буферном раствореF251с рН 7,5 (концентрация 0,4 мг/мл), затем добавили 50 мкл раствора протеазыV8 с концентрацией 1 мг/мл. Далее пробирки закрыли пробками и термостатировали при температуре 35oС в течение 4 ч. Реакцию останавливали прибавляя по 350 мкл сульфатного буферного раствора с рН 2,0. Продукты ферментативного гидролиза анализировали методом ВЭЖХ.3.9. Получение ГИЧ3.9.1. Солюбилизация ТВ и восстановление РП.Суспензию тел включения переносили из морозильной камеры и оттаивалипри комнатной температуре (длительность оттаивания 15 – 16 ч). Рассчиталиколичества реактивов, необходимых для приготовления раствора, исходя изобъема суспензии ТВ с учетом увеличения объема на 1/5 при растворениимочевины.ТВ растворяли в буфере, содержащем 8 М мочевину, 0,5% гидроксида аммония (в соотношение 1ч ТВ:3ч буферного раствора) в течение 1,5-2 ч. Далеедобавляли 10 мМ дитиотреитола и проводили восстановление дисульфидныхсвязей при t = 25˚С в течение 1,5 ч.3.9.2.
Ренатурация РП и хроматографическая очистка на анионитеРенатурацию рекомбинантного белка проводили в буферном растворе (25 мМтрис, 0,5 мМ ЭДТА).Объем раствора рассчитывается, исходя из конечной концентрации РП в реакционной смеси 0,9 ±0,1 г/л, разбавление раствора восстановленного белкапри этом составляет 35±5 раз.К раствору, содержащему рекомбинантный белок, прилили буферный раствордля ренатурации, разбавляя исходный образец в 40 раз.По окончании инкубации рН реакционной массы довели до 7,5±0,02.Полученный раствор ренатурированного белка наносили на предварительноуравновешенную фазой «А» колонну, упакованную сорбентом ДЭАЭ-сефароза.F252Подвижная фаза «А»: трис (25 мМ) в воде очищенной, рН 7,5.Подвижная фаза «Б»: трис (25 мМ) в воде очищенной, хлорид натрия (1 М),рН 7,5.Рекомбинантный белок элюировали в комбинированном режиме: градиентизократика.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
