Разработка научных основ создания технологии выделения и очистки генно-инженерных белков (1090305), страница 37
Текст из файла (страница 37)
Элюировали белок, градиентнозаменяя фазу «А» на фазу «Б» (от 0 % «Б» до 100 % «Б» за 10 колоночныхобъемов). Фракции собирали и анализировали методами SDS-PAGE, SEC иОФ ВЭЖХ.Фракции разбавляли этиловым спиртом до его концентрации 10 % об. и наносили на предварительно уравновешенную фазой «В» колонну, упакованную сорбентом Kromasil C4. Элюировали белок, градиентно заменяя фазу«В» на фазу «Г» (от 0 % «Г» до 100 % «Г» за 10 колоночных объемов). Фракции собирали и анализировали методами SDS-PAGE, SEC, ЛАЛ-тест и ОФВЭЖХ.3.11.3. Тангенциальная фильтрацияФильтрование на системе для тангенциальной фильтрации производилось сцелью перебуферирования и обессоливания исходного раствора белка.Для проведения тангенциальной фильтрации собрали установку для TFF, всостав которой входят:насос производительностью не менее 120 мл/мин;держатель (холдер).
Предварительно депирогенизированный в сухожаровомшкафу;2 кассеты Pall Centasette 2, 1 kDa (Германия). Стерилизованы и апирогенныпроизводителем;система Millipore, 5 ft2 (США).Предварительно установка для TFF ,была подготовлена к работе так, как сказано в руководстве пользователя.3.11.4.
Сушка субстанции ИГПодготовительным этапом перед лиофильной сушкой гларгина является стерильная фильтрация рабочего раствора.Стерильную фильтрацию раствора целевого белка проводили в чистом помещении класса «Д».F260Для проведения процесса использовали одноразовую фильтровальную систему с мембранным фильтром Sartolab 180C3, 0,22µм, PES (Sartorius Stedim,Германия) и вакуумный насос.Отфильтрованный раствор разлили по лоткам и заморозили.Замороженный раствор гларгина сушили на установке лиофильной сушкеFreez dryer Delta 1/А (Christ, Германия) при температуре минус (10±1) 0С, досушивали при (30±1) 0С, затем фасуют в ламинарном шкафу, маркировали ипередавали в ОКК.Параметры сушки:- температура подогрева полок минус (10±1) °С;- вакуум до 0,01 атм;- продолжительность сушки 44 -48 ч;- досушивали после основной сушки, запуская нагрев полок до (30±1) °С, втечение 2-3 ч.3.12.
Получение Инт-Г3.12.1. Солюбилизация ТВ и восстановление.Тела включения, полученные после разрушения клеток, растворяли в течение1 ч при интенсивном перемешивании в буферном растворе для денатурации,содержащем 6 М гуанидин гидрохлорид, 25 мМ цистеин, 50 мМ ацетат аммония, 2 мМ ЭДТА, рН 5,0. Полученную суспензию центрифугировали при5000G в течение 30 мин для удаления нерастворенного осадка. Надосадочную жидкость охлаждали при 50С.3.12.2. Ренатурация.Полученный охлажденный раствор ренатурировали при 50С. Для этого покаплям при медленном перемешивании вносили раствор в буфер, содержащий 2М мочевину, 50 мМ ацетата аммония, рН 5,0, а также 10 мМ метионина. После окончания внесения (разбавления белка в 10 раз) перемешивалиF261еще в течение 2-ух минут и останавливали перемешивание. Оставляли в покое на 1 ч.Поистечение этого срока снова разбавляли в 10 раз вторым ренатурирующимбуфером, содержащим 20 мМ трис, 0,1 М мочевину, 0,1 М метионина, рН 8,0,при очень медленном перемешивании.
После окончания внесения перемешивали еще в течение 2-ух минут и останавливали перемешивание. Оставляли впокое на 24 ч.3.12.3. Предочистка и очистка белка.Полученный ренатурат пропускали через одноразовую мембрану Sartobind Smini для отделения части примесей. Жидкость, прошедшую через мембрану,использовали для очистки. Мембрану утилизировали.Готовили следующие подвижные фазы.Фаза «А»: этиловый спирт (10 % об.), лимонная кислота (10 мМ) в ВДИ,рН 4,0;Фаза «Б»: этиловый спирт (60 % об.), лимонная кислота (10 мМ) в ВДИ,рН 2,0.Раствор Инт-Г наносили на предварительно уравновешенную фазой «А» колонну, упакованную сорбентом Kromasil C4. Элюировали белок, градиентнозаменяя фазу «А» на фазу «Б» (от 0 % «Б» до 100 % «Б» за 10 колоночныхобъемов). Фракции собирали и анализировали методами SDS-PAGE, SEC иОФ ВЭЖХ.3.12.4.
Финишная очистка и лиофильная сушка.Раствор белка на предварительно уравновешенную фосфатным буфером колонну, упакованную Sephacryl S-100.Фосфатный буфер: монофосфат натрия монозамещенный (10 мМ), фосфатнатрия дизамещенный (10 мМ), рН 7,3, доводили с помощью ортофосфорнойкислоты и/или гидроксида натрия. Буфер стерилизовали фильтрацией черезстерильный апирогенный фильтр 0,2 мкм.F262Фракцию белка элюировали и также фильтровали через стерильный апирогенный фильтр 0,22 мкм. Для проведения процесса использовали одноразовую фильтровальную систему с мембранным фильтром Sartolab 180C3,0,22µм, PES (Sartorius Stedim, Германия) и вакуумный насос.Отфильтрованный раствор разлили по лоткам и заморозили при минус 150С.Замороженный раствор гларгина сушили на установке лиофильной сушкеFreez dryer Delta 1/А (Christ, Германия) при температуре минус (15±1) 0С, досушивали при (20±1) 0С, затем фасовали в ламинарном шкафу, маркировали ипередавали в ОКК.Параметры сушки:- температура подогрева полок минус (15±1)°С;- вакуум до 0,01 атм;- продолжительность сушки 44 -48 ч;- досушивали после основной сушки, запуская нагрев полок до (20±1) °С, втечение 2-3 ч.3.13.
Получение ФСГ3.13.1. Перфузия, вирусная инактивация и предочистка.В экспериментах использовалась культуральная жидкость, полученная в результате культивирования штамма-продуцента, перфузию осуществляли ультрафильтрацией (мембрана Pellicon XL, предел отсечения 100 кДа).Вирусную инактивацию проводили на колонне, упакованной ДЭАЭ-сефарозой. На колонку наносили образец рекомбинантного ФСГ. В процессе хроматографической очистки проводили отбор проб каждой фракции и исходногонанесения для анализа на содержание ФСГ методом SDS-PAGE.Подвижные фазы:Фаза «А»: трис(гидроксиэтил)аминометан (10 мМ) растворяли в ВДИ, рН 7,3;Фаза «Б»: лимонная кислота (10 мМ), хлорид натрия (150 мМ) растворяли вВДИ, рН 3,0;F263Фаза «В»: трис(гидроксиэтил)аминометан (10 мМ г) растворяли в ВДИ, рН6,9;Фаза «Г»: трис(гидроксиэтил)аминометан (10 мМ), хлорид натрия (0,5 М)растворяли в ВДИ, рН 6,9.Фаза «Д»: трис(гидроксиэтил)аминометан (10 мМ), хлорид натрия (3 М) растворяли в ВДИ, рН 7,2.Инактивация.
Уравновешивали колонну фазой «А». Десорбировали белок фазой «В». После десорбции элюат выдерживали в течение 1 часа, а затем доводили рН до 6,9.Предочистка. Инактивированный элюат наносили на ту же колонну, уравновешенную подвижной фазой «С». Элюировали фракции, градиентно повышая концентрацию фазы «Г» относительно «С» (от 0 % «Г» до 100 % «Г» за10 колоночных объемов.3.13.2.
Аффинная и гидрофобная хроматография.Аффинную хроматографию проводили на колонне, упакованной тойоперломAF-BlueHC-650M. Фракции белка после ДЭАЭ-сефарозы разбавляли в 20 разВДИ и наносили на предварительно урвновешенную колонну (фаза «С» изпредыдущего пункта). Элюировали фракции, градиентно повышая концентрацию фазы «Г» (из предыдущего пункта) относительно «С» (от 0 % «Г» до100 % «Г» за 10 колоночных объемов.Фракции белка собирали, анализировали методом SDS-PAGE.
Затем добавляли во фракции хлорид натрия, апирогенный, фарм.категории до его концентрации 3 М.Колонну с сорбентом гидрофобных взаимодействий тойоперлом Butyl 600Mуравновешивали подвижной фазой «Д» (предыдущий пункт). Наносили раствор белка. Элюировали в градиенте от 100 % фазы «Д» до 100 % ВДИ.Фракцию ФСГ собирали и анализировали с помощью SDS-PAGE.3.13.3. Финишная очистка и лиофильная сушка.F264Раствор белка на предварительно уравновешенную фосфатным буфером колонну, упакованную сефадексом G-75.Фосфатный буфер: монофосфат натрия монозамещенный (10 мМ), фосфатнатрия дизамещенный (10 мМ), рН 7,3, доводили с помощью ортофосфорнойкислоты и/или гидроксида натрия.
Буфер стерилизовали фильтрацией черезстерильный апирогенный фильтр 0,2 мкм.Фракцию белка элюировали и также фильтровали через стерильный апирогенный фильтр 0,22 мкм. Для проведения процесса использовали одноразовую фильтровальную систему с мембранным фильтром Sartolab 180C3,0,22µм, PES (Sartorius Stedim, Германия) и вакуумный насос.Отфильтрованный раствор разлили по лоткам и заморозили при минус 150С.Замороженный раствор гларгина сушили на установке лиофильной сушкеFreez dryer Delta 1/А (Christ, Германия) при температуре минус (15±1) 0С, досушивали при (20±1) 0С, затем фасовали в ламинарном шкафу, маркировали ипередавали в ОКК.Параметры сушки:- температура подогрева полок минус (15±1)°С;- вакуум до 0,01 атм;- продолжительность сушки 44 -48 ч;- досушивали после основной сушки, запуская нагрев полок до (20±1) °С, втечение 2-3 ч.F265ВЫВОДЫ(1). Предложен универсальный методологический алгоритм разработки технологии выделения и очистки различных генно-инженерных белков, являющихся объектами биофармацевтики.(2).
Проведена практическая апробация алгоритма на пяти примерах – препаратах, полученных из прокариотических и эукариотических продуцентов.(3). Разработана промышленная технология выделения и очистки генно-инженерного инсулина человека. Общий биопроцессуальный выход составил270 г белка / м3 культуральной жидкости. Продукт полностью аттестован, зарегистрирован и вышел на фармацевтический рынок.(4).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
