Разработка научных основ создания технологии выделения и очистки генно-инженерных белков (1090305), страница 36
Текст из файла (страница 36)
Градиент задали с помощью градиентной программы хроматографической системы: от 0 до 100 % фазы «Б».Переводили процесс элюции РП из градиентного режима в изократическийвручную, ориентируясь на значение проводимости элюента. Основную частьрекомбинантного белка сняли с сорбента при достижении величины проводимости элюента 10,5 -11,5 µS/сm.Затем процесс снова перевели в градиентный режим.3.9.3.
Ферментативный гидролизПеред гидролизом РП блокировали цитраконовым ангидридом в соотношении 0,5 г ангидрида / 1 г белка в течение 1 ч при быстром перемешивании вкомнатной температуре. После блокирования довели рН до 7,5 с помощьюNaOH. Затем запускали гидролиз, добавляя одновременно трипсин и карбоксипептидазу В.Операцию проводили в холодном боксе с температурой (5±2) °С.Время гидролиза 24 ч. Полученный в результате гидролиза инсулин деблокировали подкислением до рН 2,5 с помощью HCl, длительность деблокирования - 24 ч.Раствор инсулина после деблокирования концентрировали на установке длятангенциальной фильтрации.
Для проведения тангенциальной фильтрациисобрали установку для TFF, в состав которой входят:насос производительностью не менее 120 мл/мин;держатель (холдер). Предварительно депирогенизированный в сухожаровомшкафу;F2532 кассеты Pall Centasette 2, 1 kDa (Германия). Стерилизованы и апирогенныпроизводителем;система Millipore, 5 ft2 (США).Предварительно установка для TFF ,была подготовлена к работе так, как сказано в руководстве пользователя.3.9.4.
Хроматографическая очисткаРаствор гларгина поступает на очистку методом ОФ ВЭЖХ.В рабочий раствор добавляют10 % по объему 96-97 %-ного этанола.Инсулин элюировали в градиентном режиме (от 100 % фазы «А» до 100 %фазы «Б»), контролируя процесс по графику оптической плотности (λ=280нМ). Фракцию, содержащую не менее 97,5 % инсулина, (по результатамВЭЖХ-анализа) передали на стадию гель-фильтрации.Подвижная фаза «А»: лимонная кислота (10 мМ), этиловый спирт (10 % об.)в ВДИ.Подвижная фаза «Б»: этиловый спирт (50 % об) в ВДИ.3.9.5.
Гель-фильтрацияОперации проводили в чистом помещении класса «Д».Гель-фильтрацию проводили на колонне с сефадексом G-50, уравновешенной0,5 М уксусной кислотой. Наносили раствор инсулина из расчета не более 8%колоночного объема. Элюировали 0,5 М уксусной кислотой в ВДИ. Фракциюинсулина собирали и осаждали 0,1 М ацетатом цинка. Осадок отделяли центрифугированием, растворяли в 0,1 М лимонной кислоте, стерильно фильтровали через фильтр 0,2 мкм.
К раствору добавляли хлорид цинка до концентрации 5% по массе. Кристаллизацию запускали, доводя рН до 6,7. Проводили кристаллизацию при комнатной температуре в течение 24 ч. Полученные кристаллы замораживали.3.9.6. Сушка субстанции ИГF254Замороженные кристаллы цинк-инсулина сушили на установке лиофильнойсушке Freez dryer Delta 1/А (Christ, Германия) при температуре минус(10±1) 0С, досушивали при (20±1) 0С, затем фасовали в ламинарном шкафу,маркировали и передавали в ОКК.Параметры сушки:- температура подогрева полок минус (10±1) °С;- вакуум до 0,01 атм;- продолжительность сушки 44 -48 ч;- досушивали после основной сушки, запуская нагрев полок до (20±1) °С, втечение 2-3 ч.3.10.
Получение ИГ3.10.1. Солюбилизация ТВ и восстановление РП.Суспензию тел включения переносили из морозильной камеры и оттаивалипри комнатной температуре (длительность оттаивания 15 – 16 ч). Рассчиталиколичества реактивов, необходимых для приготовления раствора, исходя изобъема суспензии ТВ с учетом увеличения объема на 1/5 при растворениимочевины.ТВ растворяли в буфере, содержащем 8 М мочевину, 25 мМ триса (в соотношение 1ч ТВ:3ч буферного раствора) в течение 1,5-2 ч. Далее добавляли 10мМ дитиотреитола и проводили восстановление дисульфидных связей при t =25˚С в течение 1,5 ч.3.10.2. Ренатурация РП и хроматографическая очистка на анионитеРенатурацию рекомбинантного белка проводили в буферном растворе (25 мМтрис, 0,5 мМ ЭДТА).Объем раствора рассчитывается, исходя из конечной концентрации РП в реакционной смеси 0,8 ±0,1 г/л, разбавление раствора восстановленного белкапри этом составляет 35±5 раз.F255К раствору, содержащему рекомбинантный белок, прилили буферный раствордля ренатурации, разбавляя исходный образец в 40 раз.По окончании инкубации рН реакционной массы довели до 7,7±0,02.Полученный раствор ренатурированного белка наносили на предварительноуравновешенную фазой «А» колонну, упакованную сорбентом ДЭАЭ-сефароза.Подвижная фаза «А»: трис (25 мМ) в воде очищенной, рН 7,7.Подвижная фаза «Б»: трис (25 мМ) в воде очищенной, хлорид натрия (1 М),рН 7,7.Рекомбинантный белок элюировали в комбинированном режиме: градиентизократика.
Градиент задали с помощью градиентной программы хроматографической системы: от 0 до 100 % фазы «Б».Переводили процесс элюции РП из градиентного режима в изократическийвручную, ориентируясь на значение проводимости элюента. Основную частьрекомбинантного белка сняли с сорбента при достижении величины проводимости элюента 10,5 -11,5 µS/сm.Затем процесс снова перевели в градиентный режим.3.10.3. Ренатурация с помощью мембранных адсорберовДля изучения возможности применения мембранной хроматографии в биофармацевтических процессах, а именно для ренатурации и денатурации РБиспользовалась ионообменная мембрана Sartobind nano Q, 3 – 5 um, высотаслоя 4 мм, площадь поверхности мембраны 36 см2 (Sartorius Stedim, Германия).
Мембранный объем (МО) – примерно 10 мл (объем сорбирующей поверхности – 1 мл).Состав фаз для проведения процессов:2.1. процесс – трехфазная буферная система:А: 8 М мочевина, 25 мМ трис, 10 мМ ДТТ,Б: 25 мМ трис,F256С: 25 мМ трис, 1 моль NaCl.2.2. процесс – двухфазная буферная система:А: 8 М мочевина, 25 мМ трис, 10 мМ ДТТ,Б: 25 мМ трис, 1 моль NaCl.2.3. процесс - трехфазная буферная система:А: 8 М мочевина, 25 мМ трис,Б: 8 М мочевина, 25 мМ трис, 10 мМ ДТТ,С: 25 мМ трис, 0,2 моль NaCl.2.4. процесс – четырехфазная буферная система:А: 8 М мочевина, 25 мМ трис,Б: 8 М мочевина, 25 мМ трис, 10 мМ ДТТ,С: 25 мМ трис, 0,5 мМ ЭДТА,D: 25 мМ трис, 0,2 моль NaCl.Перед началом опыта мембрану уравновешивали фазой А в количестве, равном трем колоночным объемам.3.10.4.Ферментативный гидролизОперацию проводят в холодном боксе с температурой (5±2) °С.Очищенный на анионите рекомбинантный белок, содержащий более 70 %мономерного белка, разбавляли соответствующим органическим модификатором (ДМСО, ДМФА, изопропиловый и этиловый спирт, ацетон или ацетонитрил) до его концентрации 40-60 % об., подвергали ферментативному гидролизу трипсином при температуре в реакционной смеси (5±2) °С в течение65 – 67 ч.
Полученный в результате гидролиза гларгин первично выделялиосаждением, центрифугированием для дальнейшей очистки методом ОФВЭЖХ.Останавливали гидролиз, подтитровывая раствор до рН 3,0 или ниже.3.10.5. Хроматографическая очисткаРаствор гларгина поступает на очистку методом ОФ ВЭЖХ.В рабочий раствор добавляют10 % по объему 96-97 %-ного этанола.F257Гларгин элюировали в градиентном режиме (от 100 % фазы «А» до 100 %фазы «Б»), контролируя процесс по графику оптической плотности (λ=280нМ). Фракцию, содержащую не менее 97 % гларгина, (по результатам ВЭЖХанализа) передали на стадию тангенциальную фильтрацию.Подвижная фаза «А»: лимонная кислота (10 мМ), этиловый спирт (10 % об.)в ВДИ.Подвижная фаза «Б»: этиловый спирт (50 % об) в ВДИ.3.10.6.
Тангенциальная фильтрацияФильтрование на системе для тангенциальной фильтрации производилось сцелью перебуферирования и обессоливания исходного раствора белка.Для проведения тангенциальной фильтрации собрали установку для TFF, всостав которой входят:насос производительностью не менее 120 мл/мин;держатель (холдер). Предварительно депирогенизированный в сухожаровомшкафу;2 кассеты Pall Centasette 2, 1 kDa (Германия). Стерилизованы и апирогенныпроизводителем;система Millipore, 5 ft2 (США).Предварительно установка для TFF ,была подготовлена к работе так, как сказано в руководстве пользователя.3.10.7.
Сушка субстанции ИГПодготовительным этапом перед лиофильной сушкой гларгина является стерильная фильтрация рабочего раствора.Стерильную фильтрацию раствора целевого белка проводили в чистом помещении класса «Д».Для проведения процесса использовали одноразовую фильтровальную систему с мембранным фильтром Sartolab 180C3, 0,22µм, PES (Sartorius Stedim,Германия) и вакуумный насос.F258Отфильтрованный раствор разлили по лоткам и заморозили.Замороженный раствор гларгина сушили на установке лиофильной сушкеFreez dryer Delta 1/А (Christ, Германия) при температуре минус (10±1) 0С, досушивали при (20±1) 0С, затем фасовали в ламинарном шкафу, маркировали ипередавали в ОКК.Параметры сушки:- температура подогрева полок минус (10±1) °С;- вакуум до 0,01 атм;- продолжительность сушки 44 -48 ч;- досушивали после основной сушки, запуская нагрев полок до (20±1) °С, втечение 2-3 ч.3.11.
Получение БМГ3.11.1. Экстракция белка.Целевой белок выделяли из дезинтеграта клеточной массы с помощью экстракции 1,0-2,5 % хлорной кислотой. Для этого медленно (в течение 10-15мин) при активном перемешивании добавляли концентрированную хлорнуюкислоту в суспензию дезинтеграта до установления рН менее 2,0. При этомрекомбинантный N,N-бисметионилгистон Н1.3 оказывался в надосадочнойжидкости, которую отделяли от коагулированных примесей на сепараторе.3.11.2. Очистка белка.Готовили следующие подвижные фазы.Фаза «А»: лимонная кислота (10 мМ) в ВДИ, рН 3,0;Фаза «Б»: лимонная кислота (10 мМ) в ВДИ хлорид натрия (2 М), рН 3,0;Фаза «В»: этиловый спирт (10 % об.), лимонная кислота (10 мМ) в ВДИ,рН 4,0;Фаза «Г»: этиловый спирт (50 % об.), лимонная кислота (10 мМ) в ВДИ,рН 2,0.F259Колонну, упакованную сульфопропильным сорбентом BioPro S75, уравновешивали фазой «А» и наносили раствор белка.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
