Разработка научных основ создания технологии выделения и очистки генно-инженерных белков (1090305), страница 31
Текст из файла (страница 31)
Влияние значения рН денатурирующего раствора на качество растворения ТВ.F207Таки образом, использовали раствор, содержащий 6 М гуанидин гидрохлорид, 50 мМ ацетат аммония, 2 мМ ЭДТА, рН 5,0. Кроме того, для разрыва ненативных дисульфидных связей между остатками цистеинов в белке в солюбилизирующий буфер вносят восстанавливающие агенты. Мы изучали влияние этих агентов как на качество восстановления, так и на последующую ренатурацию (Рисунок 84).FРисунок 84.
Влияние различных восстановителей в составе денатурирующего буфера на качество денатурации и ренатурации.F208Очевидно, что наилучшие показатели (содержание мономера в денатурантеоколо 60 % и в ренатуранте около 30 %) были получены при добавлении вденатурирующий раствор 25 мМ цистеина. Содержание мономера во всехслучаях оценивали с помощью метода Лэммли.4.2.
Ренатурация Инт-Г.Рефолдинг растворенного белка инициировали удалением из солюбилизирующего буфера денатуранта. Стоит особенно подчеркнуть, что наличие трехостатков цистеина в белке, из которых только два образуют дисульфиднуюсвязь, сильно осложняет задачу ренатурации. Подобные рекомбинантные молекулы, как интерферон, обладают особенностью сворачиваться в нативнуюструктуру при низких концентрациях в буферных растворах. Поэтому ренатурацию проводили поэтапно: сначала очень медленно снижали концентрацию белка в растворе, а затем удаляли денатуранты из состава буферного раствора.Первый этап подразумевает сохранение денатурирующих условий, но снижение концентрации белка. Однако слишком высокие концентрации денатуранта могут снизить качество ренатурации на втором этапе.
Поэтому нами изучались два основных параметра: концентрация остаточного денатуранта истепень разбавления белка. Как видно из матричного графика, представленного ниже (Рисунок 85), качество ренатурации достигает максимума и далеепрактически не меняется при разбавлении белка в 10 раз и выше. Влияниеконцентрации хаотропного агента на ренатурацию имеет область экстремума- оптимальных результатов ренатурации удалось добиться при сниженииконцентрации хаотропного агента в 2,5-5 раз.F209FРисунок 85. Влияние степени разбавления белка и хаотропного агента на качество ренатурации.Поэтому на первом этапе ренатурацию запускали, прибавляя по каплям раствор восстановленного и денатурированного белка в первый ренатурирующий буфер, содержащий 2М мочевину (чтобы добиться снижения концентрации хаотропного агента примерно в 3 раза), 50 мМ ацетата аммония, рН 5,0, атакже 10 мМ метионина в качестве антиоксиданта.
В ходе этого процессараствор белка разбавляли десятикратно при медленном перемешивании притемпературе +5 0С. Затем полученный раствор по каплям вносили во второйренатурирующий буфер, содержащий 20 мМ трис, 0,1 М мочевину, 0,1 М метионина, рН 8,0 – опять разбавляя в десять раз.
Второй этап процесса вели втечение суток при температуре +5 0С. Разбавление в 10 раз на втором этапепроводили, исходя из экспериментальных данных (Рисунок 86), которые наглядно демонстрируют, что большее разбавление просто не требуется (т.к. качество ренатурации не увеличивается), а меньшее разбавление не приводит кдолжному сворачиванию белка.Содержание мономера, %F21032302826242220181614121086420110100Степень разбавления белкаFРисунок 86. Влияние степени разбавления белка на втором этапе ренатурации на ее качество.Более того, при недостаточном разбавлении на втором этапе значительнаячасть белка выпадала в осадок, что связано с его агрегированием в следствиеобразования межмолекулярных цистеиновых мостиков.Итак, ренатурированный Инт-Г был получен с концентрацией 0,1±0,01 мг/мли чистотой 30±6 % по данным внутрипроизводственного контроля (SDSPAGE).4.3.
Очистка Инт-Г и получение АФС.Предочистку гибридного предшественника проводили с помощью мембранной катионообменной хроматографии на сульфопропильных мембранахSartobind S mini в режиме «проскока», то есть при пропускании раствора белка через мембрану задерживались примеси, в то время как собственно целевой белок не сорбировался.Раствор белка, предочищенный на мембранном адсорбере, далее очищали наОФ ВЭЖХ, пользуясь разработками, полученными в случае БМГ – белка,F211сильно похожего на Инт-Г по своим физико-химическим свойствам и молекулярной массе.
Образец наносили на предварительно уравновешенную колонну, упакованную силикагелем, модифицированным бутильным лигандом(Kromasil C4-300-16). Элюировали белок, градиентно повышая содержаниеэтилового спирта в подвижной фазе и понижая ее рН (Рисунок 87).FРисунок 87. Хроматограмма ОФ ВЭЖХ-очистки Инт-Г (фракция 1 соответствует целевому белку).Голубая линия – УФ-детекция (mAu) процесса; зеленая – количество этилового спирта в подвижнойфазе (% об). Колонна Ø100 мм, объем 3,5 л.
Подвижная фаза: 10 мМ лимонная кислота в воде для инъекций, рН от 4,0 до 2,0, градиент этилового спирта от 10 до 60 % об.По данным внутрипроизводственного контроля (SDS-PAGE) чистота полученного после стадии основной очистки Инт-Г составила 96±1 %. Выход60±8 %.Финишную очистку проводили с помощью гель-фильтрации. Для этого наносили раствор белка на предварительно уравновешенную фосфатным буферомколонну, упакованную сорбентом Sephacryl S-100. Элюат собирали и замораживали, после чего лиофильно высушивали до получения сухой субстанции свлажностью не более 10 %.F212Разработанная технология выделения и очистки Инт-Г позволила получитьАФС, удовлетворяющую требованиям спецификации (Таблица 31) с общимбиопроцессуальным выходом примерно 100 г / м3 культуральной жидкости.Таблица 31. Результаты контроля качества готовой субстанции Инт-Г.ПоказательМетодСпецификация(Норма)*Полученная АФСБактериальныеэндотоксины, ЕЭ/мгЛАЛ-тестне более 100,24–0,48Активность (в пересчетена сух.
вещество)Клеточный тестIC50: 0,5-3,52,1Содержание Инт-Г, %SDS-PAGEне менее 9597Высокомолекулярныебелки, %SDS-PAGEне более 2,01,5Низкомолекулярныебелки, %SDS-PAGEне более 2,00,5Остаточные белкипродуцента, нг/мкгИФАне более 0,20,014Остаточная ДНКпродуцента, нг/мгПЦРне более 2,00,5* Фармакопейная статья предприятия на интерферон-гамма (ООО «Фарма Ген», СанктПетербург).В общем виде технологическая схема процесса может быть представленаследующим образом.
Биопроцесс проводят в промышленном ферментере, затем заиндуцированные клетки собирают на сепараторе и дезинтегрируют гомогенизатором Гаулина. Дезинтеграт - ТВ - отмывают буферными растворамии концентрируют сепарацией, центрифугированием или микрофильтрацией.Затем ТВ растворяют в денатурирующем буфере, содержащем гуанидингидрохлорид в качестве хаотропного агента и цистеин в качестве восстановителя. Растворенные ТВ осветляют микрофильтрацией и рефолдируют выделенный восстановленный белок в два этапа: сначала десятикратным разбавлением в буфере, содержащим пониженную концентрацию хаотропного агента(мочевины), а затем - еще десятикратным разбавлением ренатурирующимF213буфером. Ренатурат очищают от примесей на мембранной хроматографии, азатем очищают с помощью ВЭЖХ.
Чистые фракции собирают и подвергаютгель-фильтрации с целью перевода в формулирующий буферный раствор.Элюат стерилизуют фильтрацией через фильтры 0,2 мкм, замораживают илиофильно высушивают. Схема процесса представлена ниже (Рисунок 88).F214Вода очищеннаяP-152P-125P-152P-125P-125P-125P-125P-125P-125P-125P-125P-148Емкость срастворомформалина длястерилизацииP-153P-149P-160E-126P-150E-114СепараторЕмкость срастворомглюкозы дляподпиткиE-113P-174E-112Емкость срастворомаммиака длядоведения рНP-350P-352P-358P- 196Сепарация клетокE-219E-121P-183E-100Емкость дляконцентрированныхклетокP-188Емкость спитательнойсредойE-220Емкость дляутилизацииотходовP-189P-167P-175E-125Емкость сбуфернымраствором дляотмывки P-211ТВЕмкость сденатурирующимрастворомP-210Стерильная фильтрацияЕмкость для жидкойАФСP-213Мочевина на растворение ТВE-215E-122E-133E-134ЛиофилизацияE-101P-354БиопроцессЛиофильная машинаP-197P-187E-103E-221V-35ФерментерE-141P-157E-142P-199ГомогенизаторГаулинаE-128Мочевина на растворение ТВE-143E-118P-165ДезитеграцияP-198P-363Мочевина на растворение ТВP-253Готовая АФС нахранениеP-211E-109P-173E-222Емкость длярастворения ТВМикрофильтрация раств.
ТВМикрофильтрация ТВP-201E-117P-362P-212Емкость длясуспензии ТВE-131E-138P-209E-129P-204P-220P-224E-139P-218P-229Емкость дляренатурации (1этап)P-253P-217E-145E-145P-253Емкость дляренатурации (2этап)P-253МембраннаяхроматографияE-170E-165Финишная очисткаХроматографическая очисткаP-232P-316E-170E-197P-253ГельфильтрацияE-193ВЭЖХколоннаФракцииИнт-ГP-299ФракцииИинт-ГE-147E-154E-194P-322P-235P-310P-348E-190P-233E-152P-255P-232P-316P-260P-303E-187P-309P-302E-191Емкости дляготовыхподвижныхфазХроматографическаясистемаP-303Емкости дляготовыхподвижныхфазP-258P-320E-189P-257E-150P-259ХроматографическаясистемаP-260P-275E-166P-274E-167P-273E-168P-272E-169V-41V-44P-269P-321P-267P-265P-266P-312P-315V-45P-268V-40P-313P-276E-192E-171P-270P-308P-303Емкости дляприготовленияподвижныхфазP-309E-195Емкости дляприготовленияподвижныхфазE-199P-319P-311P-260P-257P-258E-153E-149E-151P-261P-259P-262E-146P-263P-264Емкость дляутилизацииотходовFВода для инъекцийE-164P-230P-346P-230Рисунок 88. Схема выделения и очистки Инт-Г.P-261P-230P-230P-230F2155.
Создание промышленной технологии выделения и очисткифолликулостимулирующего гормона в производстве препарата-биодженерика.Проблема бесплодия в России является одной из актуальных проблем здравоохранения. По оценкам специалистов, каждая шестая пара в нашей странеявляется бесплодной [348]. Поиск решения данной проблемы идет как в на‑правлении клинических вопросов (создание новых лекарственных препаратов, новые схем лечения), так и в области эмбриологии (новые среды и методы культивирования эмбрионов, новые приборы и оборудование).Одним из перспективных препаратов для терапии бесплодия являются препараты на основе ФСГ, которые используются для лечения бесплодия у женщинначиная с середины ХХ века.ФСГ – гликопротеиновый гормон, относящийся к группе питуитарных гормонов (гонадотропинов), продуцируемых передней долей гипофиза.
Все гонадотропины являются димерными белками, состоящими из двух неодинаковых гликопротеиновых субъединиц, связанных нековалентно. α-субъединицасостоит из 92 а.о., в том числе 12 остатков цистеина, образующих 5 дисульфидных связей в положении 7 - 31, 10 - 60, 28 - 82, 32- 84 и 59- 87 (Рисунок89) [349]. Два N-связанных олигосахарида α – субъединицы располагаются‑при остатках аспарагина в положении 52 и 78. Гормон-специфичная β-субъединица ФСГ состоит из 111 аминокислот, имеет шесть дисульфидных связейв положении 3- 51, 17- 66, 20- 104, 28- 82, 32- 84, 87- 94 соответственно [350].‑Изоэлектрическая точка колеблется (в силу вариабельности гликозидногофрагмента) в диапазоне от 5,5 до 3,8 [351].‑F216FРисунок 89.
Аминокислотная последовательность рекомбинантного ФСГ человека. Красным цветомотмечены остатки цистеинов: одиннадцать дисульфидных связей.Применение методов рентгеноструктурного анализа позволило определитьпространственную структуру субъединиц ФСГ. Пространственные конформации как α-, так и β - субъединиц имеют схожую топологию, для которойхарактерным фрагментом является «цистиновый узел». Он образован тремядисульфидыми связями: связь между остатками Cysα10 (β3) и α60 (β51) проходит через кольцо, образованное двумя дисульфидными мостиками междуостатками Cys 28-82 и Cys 32- 84 (остатки цистина одинаковы как α-, так и βсубъединицы).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
