Разработка научных основ создания технологии выделения и очистки генно-инженерных белков (1090305), страница 30
Текст из файла (страница 30)
Для этого определенный объем сорбента депирогенизировали несколько раз до тех пор, пока селективность последующей очистки БМГ еще наблюдалась. Как только селективность исчезала, и выход чистого продукта падал ниже 50 %, считали, чтосорбент пришел в негодность. Кроме того, рассчитывали то количество БМГ,которое можно почистить на определенном батче сорбента, депирогенизируемого после каждого цикла очистки тем или иным способом.F201Отметим, что в соответствии с результатами депирогенизации использованиеNH4OH в фазах приводило к заметному сокращению срока эксплуатации сорбента.Таблица 29.
Влияние различных протоколов депирогенизации сорбента на его жизнеспособность.Вещество в фазеЧисло цикловКоличество БМГ,депирогенизациикоторое можнопочистить на 1кгсорбента, г*NaOH, 1 М33413NH47588NH43538H3Более 60Более 75020015187Использование фосфорной кислоты для депирогенизации позволило увеличить срок эксплуатации неподвижной фазы и воспроизводимо получать продукт, соответствующего нормативным документам.Поэтому протокол депирогенизации ВЭЖХ-сорбента должен выглядеть следующим образом:(1).
После проведения цикла очистки БМГ в штатном режиме колонна промывается подвижной фазой, содержащей 70 % этанола (или изопропанола) вВДИ с добавлением H3PO4 до концентрации 0,02 М в течение не менее 2-ухколоночных объемов, но не более 2-ух часов.(2). Затем колонна промывается 40 % этанолом в ВДИ для вытеснения кислоты и нейтрализации сорбента.(3). Колонна уравновешивается и снова готова к работе.3.4.4.
Получение АФС.F202На финальной стадии раствор БМГ был сконцентрирован на тангенциальнойультрафильтрации. Для этого его первоначально разбавляли с помощью ВДИв 10 раз. Сначала сконцентрировали белковый раствор до объема 0,5 л. Затемраствор разбавили в 10 раз ВДИ и продолжили концентрирование до того жеобъема. Цикл разбавления/концентрирования проводили пять раз (5 пассажей). После пятого пассажа белок сконцентрировали до минимально возможного объема раствора. Затем вытеснили белок из системы 2 л ВДИ. Полученный после тангенциальной фильтрации раствор белка фильтровали стерильно через глубинный фильтр 0,2 мкм, замораживали при -150С и лиофилизировали до сухого состояния (влажность не более 10 %).Разработанная технология выделения и очистки БМГ позволила получитьАФС, удовлетворяющую требованиям спецификации (Таблица 30) с общимбиопроцессуальным выходом примерно 80 г / м3 культуральной жидкости.Таблица 30.
Результаты контроля качества готовой субстанции БМГ.ПоказательМетодСпецификация(Норма)*Полученная АФСБактериальныеэндотоксины, ЭЕ/мгЛАЛ-тестне более 0,50,24–0,48Активность (в пересчетена сух. вещество)Клеточный тестIC50: 0,5-3,52,1Содержание БМГ, %ОФ ВЭЖХне менее 97,598,5Высокомолекулярныебелки, %SDS-PAGEне более 1,00,2Низкомолекулярныебелки, %SDS-PAGE, SECне более 1,00,70Родственные примеси, % ОФ ВЭЖХне более 20,3Остаточные белкипродуцента, нг/мгИФАне более 10021Остаточная ДНКпродуцента, нг/мгПЦРне более 105* Фармакопейная статья предприятия на аналог ритуксимаба препарат «Онкохист» (ООО«СинБио», Москва).F203В общем виде технологическая схема процесса может быть представленаследующим образом.
Биопроцесс проводят в промышленном ферментере, затем заиндуцированные клетки собирают на сепараторе и дезинтегрируют гомогенизатором Гаулина. Дезинтеграт экстрагируют хлорной кислотой иосветляют микрофильтрацией. Экстракт (надосадочную жидксть) очищаютот примесей и концентрируют с помощью катионообменной хроматографиина колонне с сульфопропильным сорбентом или соответствующем мембранном адсорбере. Чистые фракции собирают и очищают с помощью ВЭЖХ.Чистые фракции собирают и подвергают ультрафильтрации с целью перебуферирования и концентрирования. Концентрат стерилизуют фильтрацией через фильтры 0,2 мкм, замораживают и лиофильно высушивают.
Схема процесса представлена ниже (Рисунок 81).F204Вода очищеннаяP- 152P- 125P- 152P- 125P- 125P- 125P- 125P- 125P- 125P- 125P- 125P- 148Емкость срастворомформалина длястерилизацииP- 153P- 149P- 160E-126P- 150E- 114СепараторЕмкость срастворомглюкозы дляподпиткиE-113P- 174E-112Емкость срастворомаммиака длядоведения рНP- 356P- 352Сепарация клетокP- 358Емкость для ВДИP- 196E- 219P- 355P- 358E- 121Емкость дляконцентрированныхклетокP- 188Емкость для жидкойАФСЕмкость дляконцентратаP- 183E-100Емкость спитательнойсредойE-220Емкость дляутилизацииотходовP- 189P- 167V-48E-214E- 218Стерильная фильтрацияE-215P- 361P- 175E-125E- 122P- 353E-216E- 101P- 355БиопроцессP- 197V-35ФерментерP- 157P- 354ЛиофилизацияP- 360Емкость дляконцентрирования иультрафильтрацииP- 187E-103Лиофильная машинаУльтрафильтрацияP- 350E-221E-217P- 199ГомогенизаторГаулинаE-128E-118P- 165ДезитеграцияP- 363P- 198E-109Готовая АФС нахранениеP- 210P- 173E-222МикрофильтрацияэкстрактаP- 201E- 117Емкость дляэкстракцииБМГ из клетокP- 362Емкость длянадосадкаэкстрактаE- 131P- 209E- 129P- 229P- 204E-145V-39 P- 253P- 253E-165Основная очисткаХроматографическая очисткаP- 349P- 232P- 316E- 170E- 197P- 253ФракцииБМГФракции БМГВЭЖХколоннаE-193E- 147P- 299E- 154E- 194P- 322P- 235P- 310P- 348E-190P- 233E- 152E-181Колонна скатионитомилимембраннаяустановкаP- 255P- 232P- 316P- 260P- 303P- 309P- 305E- 187P- 318P- 303Емкости дляготовыхподвижныхфазP- 302E-191P- 320E-189P- 317E- 188P- 314P- 258Емкости дляготовыхподвижныхфазХроматографическаясистемаE- 196P- 257E- 150P- 259ХроматографическаясистемаP- 260P- 275E- 166P- 274E-167P- 273E-168P- 272E- 169V-41V-44P- 269P- 321P- 307P- 312P- 315P- 267P- 265P- 266P- 306V-45P- 268V-40P- 313P- 276E- 192E- 171P- 270P- 308P- 303Емкости дляприготовленияподвижныхфазP- 305P- 309E- 195E- 186E- 199P- 319P- 318P- 311Емкости дляприготовленияподвижныхфазE- 198P- 304P- 323P- 260P- 257P- 258E-153E-149E- 151P- 261P- 259P- 262E- 146P- 263P- 264FЕмкость дляутилизацииотходовВода для инъекцийE- 164P- 230P- 346P- 230Рисунок 81.
Схема выделения и очистки БМГ.P- 230261P- 230P- 230F2054. Создание промышленной технологии выделения и очисткиинтерферона-гамма в производстве препарата-биодженерика.Разработка эффективной терапии повсеместно распространенных хронических вирусных инфекций остается важнейшей проблемой современной медицины.
Препараты на основе интерферона-гамма (Инт-Г) привлекают внимание в отношении возможностей повышения эффективности лечения: многочисленных ОРВИ; «птичьего» гриппа (при сочетанном действии интерферонов I и II типов); гепатита C и ВИЧ-инфекций; туберкулезной инфекции;онкологических заболеваний.Инт-Г представляет собой белок с молекулярной массой около 16,7 кДа (145а.о.). Как видно из представленной аминокислотной последовательности (Рисунок 82), это еще один пример положительно заряженного белка (pI 9,5)[347].‑FРисунок 82.
Аминокислотная последовательность рекомбинантного Инт-Г человека. Красным цветомотмечены остатки цистеинов: одна дисульфидная связь и один свободный остаток.Стоит отметить тот факт, что в молекуле Инт-Г есть три цистеиновых остатка, только два из которых замкнуты в дисульфидную связь. Это, безусловно,осложнит ренатурацию белка при выделении его из тел включения.4.1. Выделение из клеток ТВ, денатурация Инт-Г.В качестве продуцента предшественника ИГ использовали бактериальныйштамм Е. coli BL21DE3/pIE-gamma (ООО «Фарма Ген», Санкт-Петербург;штамм депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов ФГУП «ГоНИИгенетика», коллекционный номер В-11012).
КлеткиF206культивировали в условиях, обеспечивающих накопление ТВ белка. Прикультивировании клеток штамма-продуцента белка для получения инокулятапитательную среду на основе лактозы, пептона и экстракта пекарских дрожжей засевали культурой штамма-продуцента, затем выращивали посевнойматериал в ферментере объемом 20 л. Полученный материал использовалидля засева ферментера объемом 1000 л. Ферментацию проводили до достижения культурой оптической плотности 7 ОЕ, автоиндуцируя биосинтез0,2 % лактозой.После окончания ферментации биомассу отделяли центрифугированием, разрушая на дезинтеграторе Гаулина и выделяя центрифугированием ТВ.
Отмытые от осколков клеточных стенок ТВ солюбилизировали, используя сильныйхаотропный агент - 6 М гуанидин гидрохлорид. Изучали значение рН в денатурирующем растворе, оптимальное для растворения ТВ и извлечения из нихмономера целевого белка. Экспериментально установлено, что оптимальнымзначением рН (которое также является наилучшим в отношении растворимоСтепень извлечения мономера Инт-Г из ТВ, %сти белка) является 5,0 (Рисунок 83).604020034567891011рН денатурирующего раствораFРисунок 83.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
