Главная » Просмотр файлов » Разработка научных основ создания технологии выделения и очистки генно-инженерных белков

Разработка научных основ создания технологии выделения и очистки генно-инженерных белков (1090305), страница 27

Файл №1090305 Разработка научных основ создания технологии выделения и очистки генно-инженерных белков (Разработка научных основ создания технологии выделения и очистки генно-инженерных белков) 27 страницаРазработка научных основ создания технологии выделения и очистки генно-инженерных белков (1090305) страница 272018-01-18СтудИзба
Просмтор этого файла доступен только зарегистрированным пользователям. Но у нас супер быстрая регистрация: достаточно только электронной почты!

Текст из файла (страница 27)

В качестве верхнего предела количественной оценки можно считать верхний предел линейности методики, т.е. максимальную концентрацию аналита в образце, при которой выполняется критерий линейности. Верхний предел для SEC равен 1,8 мг/мл, для ОФ ВЭЖХ 1,4 мг/мл.F175Коэффициенты вариации (в случае определения нижнего и верхнего пределовколичественной оценки) не превысили 20% значения3.1.4.

Специфичность.В случае SEC была смоделирована ситуация, которая может возникнуть принесоблюдении условий хранения или при длительном хранении препарата.При нарушении температурных условий часто наблюдается разложение действующего компонента с образованием низкомолекулярных примесей. Длямоделирования данной ситуации мы провели ферментативный гидролиз контрольного образца трипсином; полученными в ходе трипсинолиза низкомолекулярными соединениями мы искусственно загрязняли контрольные образцы.Для оценки специфичности мы использовали рабочие растворы БМГ, содержащие соответственно 0,4, 1,0 и 1,8 мг/мл и низкомолекулярные примеси(получение которых было описано выше).

Каждый из трех растворов анализировали по пять раз (Рисунок 67).В случае ОФ ВЭЖХ была смоделирована ситуация, которая может возникнуть при некачественной постадийной очистке белка (в ходе «downstream»процесса). Для определения специфичности методики ОФ ВЭЖХ использовали контрольный раствор БМГ, к которому добавляли культуральную жидкость неиндуцированной клеточной культуры E. coli, не содержащую исследуемый белок, в количестве, необходимом для получения конечной концентрации чистого гистона в образцах 0,7; 1,0 и 1,4 мг/мл. Появление описываемого спектра примесей возможно при выделении рекомбинантного БМГ изкультуральной жидкости (Рисунок 68).F176FРисунок 67.

Специфичность метода SEC: разделение гистона Н1.3 (пик 1) и низкомолекулярных примесей (пик 2).FРисунок 68. Специфичность метода ОФ ВЭЖХ: разделение гистона Н1.3 (пик 2) и примесей (1, 3-6).F177Полученные данные представлены ниже (Таблица 23).Таблица 23. Специфичность методов.Номинальная концентрация БМГ, мг/млРассчитанноесодержание БМГ, %Рассчитанная концентрацияБМГопределеннаяконцентрация± S(x), мг/млСV,%Bias,%SEC0,487,90,455±0,0163,2113,751,090,91,100±0,0393,1810,01,896,91,744±0,0827,33-3,11ОФ ВЭЖХ0,799,40,704±0,0192,450,571,092,71,079±0,0252,057,91,493,71,494±0,0452,706,71Как видно из представленных результатов, отклонения в определяемых величинах для эксклюзионной и высокоэффективной хроматографии не превысили 15%, следовательно, оба метода можно считать специфичными.3.1.5.

Устойчивость.Под устойчивостью метода понимается свойство методики давать приемлемые результаты при некотором изменении её параметров. К таким параметрам относятся состав подвижной фазы, её рН, температура и др. Рекомендуется варьировать данные показатели не менее чем на 5% от установленных вметодике.Все эксперименты по оценке устойчивости методики проводили на образце сконцентрацией БМГ 1,0 мг/мл.Для оценки устойчивости метода SEC варьировали такие параметры, кактемпература термостатирования колонки от 28 до 32 °С и состав подвижнойфазы (изменение рН от 2,8 до 3,2).F178Для ОФ ВЭЖХ варьировалась температура термостатирования колонки от 38до 420С и состав подвижной фазы (процент содержания фазы В в градиентной программе).Пределами устойчивости метода являются результаты определения рассчитанной концентрации БМГ и времени удержания, находящиеся в толерантномдиапазоне, т.е.

в интервале четырех стандартных отклонений (±2σ).Результаты оценки устойчивости используемых методов в описанных вышеусловиях представлены ниже (Рисунок 69 и Рисунок 70), из которых видно,что полученные значения не выходят за пределы интервала четырех стандартных отклонений, а методы можно считать устойчивыми к изменениютемпературы и составу подвижных фаз.FРисунок 69. Устойчивость метода SEC к изменению температуры (а) и рН подвижной фазы (б) относительно площади пика БМГ; изменению температуры (в) и рН подвижной фазы (г) относительно времени удерживания БМГ.F179FРисунок 70.

Устойчивость метода ВЭЖХ к изменению температуры (а) и состава подвижных фаз (б)относительно площади пика БМГ; изменению температуры (в) и состава подвижных фаз (г) относительно времени удерживания БМГ.Резюме. Разработаны и валидированы два хроматографических (SEC и ОФВЭЖХ) метода определения концентрации рекомбинантного БМГ в препаратах.В ходе валидации показано, что результаты определения концентрации БМГизменяются линейно внутри установленного диапазона: 0,4-1,8 мг/мл дляSEC и 0,4-1,4 мг/мл для ОФ ВЭЖХ, при этом во всех случаях коэффициентывариации и относительные систематические погрешности не превышают15%, что соответствует рекомендациям GMP. Коэффициент детерминации вусловиях как SEC, так и ОФ ВЭЖХ, близок к 1 (0,9859 для SEC и 0,9941 дляОФ ВЭЖХ).F180Оба аналитических метода определения концентрации БМГ являются правильными и точными, значения коэффициентов вариации и значения относительных стандартных отклонений не превышают 15 %.Описанные методы обладают высокой специфичностью, в условиях анализа«загрязненного» образца как с помощью SEC, так и ОФ ВЭЖХ, значения коэффициентов вариации и относительных систематических погрешностей невыходят за рамки рекомендованного GMP диапазона.При оценке устойчивости метода все результаты определения рассчитаннойконцентрации БМГ и времени удерживания находились в толерантном диапазоне, т.е.

в интервале четырех стандартных отклонений (±2σ), что доказываетвалидность методов в измененных условиях проведения анализов.Методы SEC и ОФ ВЭЖХ позволяют идентифицировать примеси различнойприроды, что является важным аспектом при проведении как внутрипроизводственного контроля, так и контроля качества БМГ в препаратах.3.2. Выделение БМГ из клеток.Культивирование клеток штамма-продуцента E.coli Bl21(DE3)/pEGT1/H1.3S(ООО «Крионикс», Санкт-Петербург) проводили в несколько этапов. На первом этапе выращивали посевной материал в колбах.

На втором этапе для выращивания продуцента в ферментере готовили и стерилизовали питательнуюсреду, содержащую аминотон, дрожжевой экстракт, фосфорнокислый двухзамещенный калий, хлористый натрий и сернокислый магний. Затем в питательную среду добавляли стерильные глюкозу и канамицин. После этогоосуществляли засев ферментера посевным материалом (0,2% об.) и выращивали клетки продуцента при температуре 37оС до достижения в культуральной жидкости оптической плотности, равной 10 оптическим единицам.

Наследующем этапе проводили индукцию синтеза рекомбинантного белка путем введения в ферментер водного стерильного раствора ИПТГ. Через2,0-2,5 ч после введения индуктора процесс биосинтеза белка останавливали,а культуру клеток подавали на сепаратор для отделения клеток от культу-F181ральной жидкости. Полученную суспензию клеток разрушали с помощьюпроточного дезинтегратора.В ходе промышленного культивирования штамм-продуцента и биосинтезаполучали БМГ, содержание которого в дезинтеграте, определенное методомSDS-PAGE, составляло всего 10%, что соответствовало выходу 160-180 г целевого белка / м3 культуральной жидкости.

Оптимизация условий ферментации не привела к заметному увеличению выхода. Однако некоторое улучшение можно было статистически проследить при снижении температуры процесса до введения индуктора ИТПГ, что связано с увеличением роста клеток.Тем не менее, рост клеток не пропорционально отражался на увеличении выхода, из чего можно заключить, что в E.coli после начала индукции в большейстепени биосинтезировались примесные белки.Рекомбинантный БМГ был выделен из культуральной жидкости, полученнойв результате культивирования штамм-продуцента, с помощью экстракции 2,5% хлорной кислотой. Целевой белок является цитоплазматическим и не образует тел включения в продуценте. Несмотря на то, что отсутствие стадий растворения тел включения в денатурирующем буфере с технологической точкизрения является преимуществом, тем не менее, образование тел включения взначительной степени защищает продукт от излишнего загрязнения бактериальными эндотоксинами клеточной стенки.

Таким образом, цитоплазматические белки должны очищаться в первую очередь от БЭ (липополисахаридов)до крайне низких значений (требование спецификации на субстанцию БМГдиктует необходимость иметь БЭ не более 0,5 ЭЕ/мг).Экстракция проходила с достаточно высоким выходом и приводила к получению раствора белка с концентрацией до 1,0 мг/мл, загрязненного примесямиразличной природы. По данным внутрипроизводственного контроля (SDSPAGE и ВЭЖХ), содержание примесей в экстракте составляло 60±15 %.Ниже представлены результаты аналитического контроля экстракции с помощью SDS-PAGE и ВЭЖХ. Необходимо отметить, что электрофоретическаяподвижность производного БМГ (Рисунок 71а) соответствует подвижностибелка с молекулярной массой 32,5 кДа (было подтверждено методом внут-F182реннего стандарта).

Это, по-видимому, связано с сильным положительнымзарядом молекулы, снижающим электрофоретическую подвижность. Каквидно из рисунка, в ходе экстракции была удалена большая часть балластныхбелков E.coli с молекулярной массой выше 35 кДа, а также значительнаячасть белков с массой менее 21 кДа.По данным ВЭЖХ анализа содержание основного вещества после экстракциисоставляло 33-46 % (Рисунок 71б).FРисунок 71. Результаты аналитического контроля стадии экстракции целевого белка из суспензиидезинтеграта клеточной массы (а – SDS-PAGE, дорожка 1 соответствует белку до экстракции, дорожка2 – белку после экстракции, дорожка 3 – стандартам масс LMW; б – обращено-фазовая ВЭЖХ, времяудержания целевого белка составляет примерно 13,4 мин).3.3. Предочистка и концентрирование БМГ.Для дальнейшей очистки белок необходимо сконцентрировать.

Методы концентрирования с помощью солевого осаждения, как ни странно, не оказалисьэффективными. Даже при использовании сульфата аммония в концентрациинасыщения, как описано [341], не удавалось осадить весь N,N-бисметионил‑гистон из раствора, значительная часть белка оставалась в надосадочнойжидкости.Для концентрирования белка ранее нами было предложено использовать катионообменную хроматографию. Ярко выраженный заряд на белке, создаваемый остатками лизина, обеспечивает отличное связывание с катионообменным сорбентом.

Характеристики

Список файлов диссертации

Свежие статьи
Популярно сейчас
Как Вы думаете, сколько людей до Вас делали точно такое же задание? 99% студентов выполняют точно такие же задания, как и их предшественники год назад. Найдите нужный учебный материал на СтудИзбе!
Ответы на популярные вопросы
Да! Наши авторы собирают и выкладывают те работы, которые сдаются в Вашем учебном заведении ежегодно и уже проверены преподавателями.
Да! У нас любой человек может выложить любую учебную работу и зарабатывать на её продажах! Но каждый учебный материал публикуется только после тщательной проверки администрацией.
Вернём деньги! А если быть более точными, то автору даётся немного времени на исправление, а если не исправит или выйдет время, то вернём деньги в полном объёме!
Да! На равне с готовыми студенческими работами у нас продаются услуги. Цены на услуги видны сразу, то есть Вам нужно только указать параметры и сразу можно оплачивать.
Отзывы студентов
Ставлю 10/10
Все нравится, очень удобный сайт, помогает в учебе. Кроме этого, можно заработать самому, выставляя готовые учебные материалы на продажу здесь. Рейтинги и отзывы на преподавателей очень помогают сориентироваться в начале нового семестра. Спасибо за такую функцию. Ставлю максимальную оценку.
Лучшая платформа для успешной сдачи сессии
Познакомился со СтудИзбой благодаря своему другу, очень нравится интерфейс, количество доступных файлов, цена, в общем, все прекрасно. Даже сам продаю какие-то свои работы.
Студизба ван лав ❤
Очень офигенный сайт для студентов. Много полезных учебных материалов. Пользуюсь студизбой с октября 2021 года. Серьёзных нареканий нет. Хотелось бы, что бы ввели подписочную модель и сделали материалы дешевле 300 рублей в рамках подписки бесплатными.
Отличный сайт
Лично меня всё устраивает - и покупка, и продажа; и цены, и возможность предпросмотра куска файла, и обилие бесплатных файлов (в подборках по авторам, читай, ВУЗам и факультетам). Есть определённые баги, но всё решаемо, да и администраторы реагируют в течение суток.
Маленький отзыв о большом помощнике!
Студизба спасает в те моменты, когда сроки горят, а работ накопилось достаточно. Довольно удобный сайт с простой навигацией и огромным количеством материалов.
Студ. Изба как крупнейший сборник работ для студентов
Тут дофига бывает всего полезного. Печально, что бывают предметы по которым даже одного бесплатного решения нет, но это скорее вопрос к студентам. В остальном всё здорово.
Спасательный островок
Если уже не успеваешь разобраться или застрял на каком-то задание поможет тебе быстро и недорого решить твою проблему.
Всё и так отлично
Всё очень удобно. Особенно круто, что есть система бонусов и можно выводить остатки денег. Очень много качественных бесплатных файлов.
Отзыв о системе "Студизба"
Отличная платформа для распространения работ, востребованных студентами. Хорошо налаженная и качественная работа сайта, огромная база заданий и аудитория.
Отличный помощник
Отличный сайт с кучей полезных файлов, позволяющий найти много методичек / учебников / отзывов о вузах и преподователях.
Отлично помогает студентам в любой момент для решения трудных и незамедлительных задач
Хотелось бы больше конкретной информации о преподавателях. А так в принципе хороший сайт, всегда им пользуюсь и ни разу не было желания прекратить. Хороший сайт для помощи студентам, удобный и приятный интерфейс. Из недостатков можно выделить только отсутствия небольшого количества файлов.
Спасибо за шикарный сайт
Великолепный сайт на котором студент за не большие деньги может найти помощь с дз, проектами курсовыми, лабораторными, а также узнать отзывы на преподавателей и бесплатно скачать пособия.
Популярные преподаватели
Добавляйте материалы
и зарабатывайте!
Продажи идут автоматически
6417
Авторов
на СтудИзбе
307
Средний доход
с одного платного файла
Обучение Подробнее