Разработка научных основ создания технологии выделения и очистки генно-инженерных белков (1090305), страница 23
Текст из файла (страница 23)
Метод контроля производства ГИЧ (а - хроматограмма образца после ферментативногогидролиза РП; б - хроматограмма образца после ВЭЖХ-очистки и последующей гель-фильтрации; в хроматограмма образца инсулина в составе неосновной фракции после ВЭЖХ, требующей повторнойочистки).Элюат ГИЧ после ОФ ВЭЖХ подвергали гель-фильтрации с целью переводабелка в ацетатный буфер.
Полученный раствор (ГИЧ в 0,5 М ацетатном буфере) кристаллизовали с хлоридом цинка, кристаллы отмывали этанолом, замораживали при -150С и лиофилизировали до сухого состояния (влажность неболее 10 %).F138Разработанная технология выделения и очистки ГИЧ позволила получитьАФС, удовлетворяющую требованиям спецификации (Таблица 18) с общимбиопроцессуальным выходом примерно 270 г / м3 культуральной жидкости.Таблица 18. Результаты контроля качества готовой субстанции ГИЧ.ПоказательМетодСпецификация(Норма)*Полученная АФСБактериальныеэндотоксины, ЭЕ/мгЛАЛ-тестне более 100,96 – 1,92Активность (в пересчете ВЭЖХна сух. вещество), МЕ/мгне менее 27,527,52Содержание ИГ, %ВЭЖХне менее 97,599,6Высокомолекулярныебелки, %ВЭЖХне более 0,30,02Родственные белки, %ВЭЖХне более 20,55Содержание дТИ, %ВЭЖХне более 2менее 0,5 %Содержание А21дезаминоинсулина, %ВЭЖХне более 20,14* Проект фармакопейной статьи предприятия на инсулин-гларгин (Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биоорганической химии им.
академиковМ.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук, Москва).В общем виде технологическая схема процесса может быть представленаследующим образом. Биопроцесс проводят в промышленном ферментере, затем заиндуцированные клетки собирают на сепараторе и дезинтегрируют гомогенизатором Гаулина. Дезинтеграт - ТВ - отмывают буферными растворамии концентрируют сепарацией, центрифугированием или микрофильтрацией.Затем ТВ растворяют в денатурирующем буфере, содержащем мочевину в качестве хаотропного агента и ДТТ в качестве восстановителя. РастворенныеТВ осветляют микрофильтрацией и рефолдируют выделенный восстановленный белок сорокакратным разбавлением в ренатурирующем буфере.
Ренатурат очищают от примесей и концентрируют с помощью анионообменнойхроматографии на колонне с ДЭАЭ-сефарозой. Чистые фракции собирают,F139блокируют в течение 1 ч цитраконовым ангидридом и гидролизуют совместно трипсином и карбоксипептидазой. По окончании гидролиза, с инсулинаснимают блокировку в течение 24 ч, затем концентрируют раствор белка спомощью тангенциальной фильтрации.
Концентрат очищают с помощьюВЭЖХ. Чистые фракции собирают и подвергают гель-фильтрации с цельюперебуферирования. Элюат кристаллизуют с хлоридом цинка, кристаллыцинк-инсулина замораживают и лиофильно высушивают. Схема процессапредставлена ниже (Рисунок 41).F140Вода очищеннаяP-152P-125P-152P-125P-125P-125P- 125P-125P-125P-125P-125P-148Емкость срастворомформалина длястерилизацииP-153P-149P-160E-126P-150E-114СепараторЕмкость срастворомглюкозы дляподпиткиE-113P-174E-112Емкость срастворомаммиака длядоведения рНP-352P-196Сепарация клетокE-121P- 183E-100Емкость дляконцентрированныхклетокP-188Емкость спитательнойсредойЕмкость дляутилизацииотходовP- 189P-167P-175E-125Емкость сбуфернымраствором дляотмывки P-211ТВЕмкость сденатурирующимрастворомP-210Емкость длякристаллов цинкинсулинаP-213Мочевина на растворение ТВДобавление хлоридацинкаE-122E-133E-215E-134E-101ЛиофилизацияP-355БиопроцессP- 197Лиофильная машинаE-221V-35ФерментерE-141P-157E-217E-142P- 199ГомогенизаторГаулинаE-128Мочевина на растворение ТВКолонна для гельфильтрацииE-143E-118P-165ДезитеграцияP-198Мочевина на растворение ТВГель-фильтрацияP-363E-150Готовая АФС нахранениеP-211E-109P-173E-222Емкость длярастворения ТВE-154E-195Микрофильтрация раств.
ТВМикрофильтрация ТВP- 201E-117P-362P-212Емкость длясуспензии ТВE-131P-220P- 204Емкость дляренатурацииE-138P-209E-129P-224E-139P-218P-229P-217E-145P-350V-39 P-253P-253E-165P-346Основная очисткаХроматографическая очисткаГидролизP-299P-349Емкость дляпроведенияферментативногогидролизаP-316E-197ФракцииГИЧP-349E-131ВЭЖХколоннаE-193P-232E-170P-253P- 301P-349Колонна сДЭАЭсефарозойФракции РПP-300E-147E-182E-154E-194P-322P-310P-235P-293P-348E-190P-233E-152E-181P-255P-232P-316P-260P-303P-309P- 305E-187P-318P-303Емкости дляготовыхподвижныхфазP-302E-191P-320E-189P-317E-188P-314P-258Емкости дляготовыхподвижныхфазХроматографическаясистемаE-196P-257E-150P-259ХроматографическаясистемаP-260P-275E-166P-274E-167P-273E-168P-272E-169V-41V-44P-269P-321P- 307P-312P-315P-267P-265P-266P-306V-45P-268V-40P-313P-276E-192E-171P-270P-308P-303Емкости дляприготовленияподвижныхфазP- 305P-309E-195P-318E-186E-199P-319P-311Емкости дляприготовленияподвижныхфазE-198P- 304P-323P-260P-257P-258E-153E-149E-151P-261P-259P-262E-146P-263P- 264P-349Емкость дляутилизацииотходовFP-230P-346P-230Рисунок 41.
Схема выделения и очистки ГИЧ.P-354КристаллизацияP-360P-187E-103P-261P-230Вода для инъекцийE-164P-230P-230F1412. Создание промышленной технологии выделения и очисткиинсулина-гларгина в производстве препарата-биодженерика.Развитие биотехнологических методов позволило в последние 10 лет создатьи ввести в лечебную практику новые аналоги инсулина человека, обладающие дополнительными терапевтическими преимуществами при сохраненииполноценной гипогликемической активности.
Примером таких внедрений является аналог инсулина пролонгированного действия – инсулин-гларгин(коммерческое название «Лантус»). ИГ – пролонгированный аналог инсулиначеловека массой около 6060 Да, в структуре которого остаток аспарагина А21заменен на остаток глицина, а В-цепь удлинена на два положительно заряженных остатка аргинина ArgB31, ArgB32, благодаря чему pI смещается до6,7 (Рисунок 42). Напомним, что такое изменение изоэлектрической точки витоге приводит к пролонгации действия препарата.FРисунок 42.
Аминокислотная последовательность молекулы ИГ. Выделены зеленым цветом те аминокислотные остатки, которые не характерны для инсулина человека. Красным цветом показаныостатки цистеинов, образующие три дисульфидные связи.Разработка эффективной технологии получения ИГ заключается не только всоздании высокопродуктивного штамма, но и в оптимизации всех стадийпроизводства, начиная от выделения рекомбинантного белка-предшественника (РП) из тел включения и заканчивая финишной очисткой ИГ. Основныеэтапы производства заключаются в выделении РП из ТВ, восстановлении(денатурация), ренатурация (рефолдинг) и очистке РП; после ферментативного расщепления РП образуется ИГ, который подвергается очистке хроматографическими методами; очищенный ИГ стерильно фильтруют, фильтратлиофильно высушивают. Каждый этап приводит к уменьшению финальноговыхода продукта технологии – субстанции ИГ.
Особенно это касается стадииF142выделения РП из ТВ, поскольку именно эта начальная стадия всей технологической цепочки является наиболее критической. Вследствие чего цельюданной работы была оптимизация стадии выделения РП из ТВ E.coli.Обеспечение максимально возможной денатурации РП определяет то количество РП, которое будет вовлечено в дальнейший производственный цикл. Таким образом, цель оптимизации денатурации – наиболее полно выделить РПиз ТВ. Последующий процесс ренатурации восстановленного РП необходимдля образования нативной структуры целевого белка, т.е. образования правильно-замкнутых дисульфидных связей.Данный процесс отягчен большим количеством побочных реакций агрегациимономера РП, а также образованием ненативных межмолекулярных и внутримолекулярных дисульфидных связей.
Следовательно, цель оптимизацииренатурации – свести к минимуму побочные реакции и получить мономер РПс правильно-замкнутыми дисульфидными связями с максимальным выходом.Стоит отметить, что одной из задач-минимум является разработка мобильного и удобного метода внутрипроизводственного контроля. Эта задача решалась нами первоочередно, так как ее решение могло бы быть использовано нетолько в технологии производства ИГ, но и в технологиях производства других белков.2.1.
Растворение ТВ и денатурация РП.В качестве продуцента предшественника ИГ использовали бактериальныйштамм Е. coli BL21DE3/pPins07 (Федеральное государственное бюджетноеучреждение науки Институт биоорганической химии им. академиков М.М.Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук). Клетки культивировали в условиях, обеспечивающих накопление тел включения гибридного белка-предшественника. При культивировании клеток штамма-продуцентагибридного белка для получения инокулята питательную среду на основегидролизата казеина и экстракта пекарских дрожжей засевали культуройштамма-продуцента, затем выращивали посевной материал в ферментереF143объемом 20 л.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
