Главная » Просмотр файлов » Разработка научных основ создания технологии выделения и очистки генно-инженерных белков

Разработка научных основ создания технологии выделения и очистки генно-инженерных белков (1090305), страница 25

Файл №1090305 Разработка научных основ создания технологии выделения и очистки генно-инженерных белков (Разработка научных основ создания технологии выделения и очистки генно-инженерных белков) 25 страницаРазработка научных основ создания технологии выделения и очистки генно-инженерных белков (1090305) страница 252018-01-18СтудИзба
Просмтор этого файла доступен только зарегистрированным пользователям. Но у нас супер быстрая регистрация: достаточно только электронной почты!

Текст из файла (страница 25)

SEC – хроматограмма ренатурированного РП: пик 5 – ренатурированный мономер РП;пик 4 – ниже предела количественной оценки, пики 2 и 3 – димерная и мультимерные формы РП (пик1 ниже предела количественной оценки).FРисунок 54. Результат ренатурации белка: 1 – LMW калибровочный стандарт (массы, сверху вниз 94,72, 64, 45, 23, 14,5 кДа); 2 – окончание ренатурации (целевой белок с молекулярной массой 17,5 кДа,остальные полосы – агрегатные примеси).F1552.4. Создание метода внутрипроизводственного контроля ИГ.Итак, полученный чистый мономер предшественника ИГ далее должен бытьподвергнут ферментативному расщеплению с целью получить собственноцелевой ИГ, избавившись от лишних аминокислотных остатков в последовательности (включая С-пептид и лидерный фрагмент).

Кроме того, гидролизатдолжен быть затем очищен от примесей до степеней чистоты, требуемыхнормативной документацией. Соответственно, опять встает вопрос о необходимости метода контроля производственных стадий. Наиболее удобным мысочли метод, опубликованный компанией Sielc Technologies [332]. Однако‑даже этот метод был достаточно долгим (30 мин) для того, чтобы максимально эффективно контролировать динамику ферментативного гидролиза РП.Нами был разработан метод, основанный на UPLC (сверхбыстрая ВЭЖХ,ultra performance liquid chromatography).С помощью UPLC это время удалось уменьшить до 4 мин, при этом не меняяни состава подвижных фаз, ни формы градиента их состава (Рисунок 55).FРисунок 55.

UPLC хроматограмма модельной смеси препарата "Лантус" с препаратом "ИнсуранР" (пик 1 - инсулин-гларгин; пик 2 - крезол; пик 3 - инсулин человека).F1562.5. Ферментативный гидролиз РП.Очищенный на анионите белок-предшественник подвергали ферментативному гидролизу трипсином с целью получения целевого ИГ (Рисунок 56).FРисунок 56.

Схема ферментативного расщепления гибридного белка-предшественника с образованиемИГ.Гидролиз проводили в присутствии водорастворимых органических растворителей, таких как ДМСО, ДМФА, этанол, ацетон, ацетонитрил, этилацетат идр. (наилучших результатов удалось добиться в ДМСО). Содержание органического растворителя составляло 40-60% по объему реакционной смеси (Рисунок 57).F157ДМСОизопропанолэтанолацетонДМФАацетонитрилэтилацетатЧистота ИГ после гидролиза, %504030201000102030405060708090100% орг.модификатораFРисунок 57.

Влияние присутствия органического модификатора на качество протекания трипсинолиза предшественника ИГ.Процесс вели при температуре в реакционной смеси (5±2) °С при медленномперемешивании. Время проведения гидролиза, а так же соотношение фермент : субстрат было установлено экспериментально (64 ч и 52 ед/г). Результат оптимизации данной стадии представлен ниже (Рисунок 58).ИГ, полученный в результате гидролиза, содержал 40±10 % целевого компонента (Рисунок 59). Остальное – продукты некорректного гидролиза (включаяпримесный дезаргинилгларгин, продукт избыточного щепления трипсиномпо С-концу В-цепи) и недорасщепленный гибридный белок.F158FРисунок 58. Оптимизация триптического расщепления предшественника ИГ по параметрам: времяпроцесса и соотношение трипсин:белок.FРисунок 59. UPLC хроматограмма гидролизата РП (пик 1 - инсулин-гларгин; пики 2 и 4 – различныепримеси (не идентифицировались); пик 3 – примесный дезаргинилгларгин).F1592.6.

Очистка ИГ и получение АФС.ИГ, полученный на стадии ферментативного гидролиза кроме целевого белка,обладающего биологической активностью, содержит ряд примесей, а именно:родственные примеси (недогидролизованный предшественник, дезаргинилгларгин и дездиаргинилгларгин), бактериальные эндотоксины, остатки ДНКпродуцента, высокомолекулярные полипептиды и т.д. Для избавления от нихбыла разработана стадия основной очистки с помощью ОФ ВЭЖХ (Рисунок60). Процесс проводили на силикагеле С8 при комнатной температуре.FРисунок 60. Хроматограмма ОФ ВЭЖХ-очистки ИГ (фракция 1 – целевой белок, фракция 2 – родственные примеси). Голубая линия – УФ-детекция (mAu) процесса; коричневая – количество этилового спирта в подвижной фазе (% об).

Колонна Ø100 мм, объем 3,5 л. Подвижная фаза: 10 мМ лимоннаякислота в воде для инъекций, рН 2,3, градиент этилового спирта от 10 до 50 % об.По результатам внутрипроизводственного контроля, чистота основной фракции ИГ составила 98±0,5 %, выход процесса ОФ ВЭЖХ-очистки 65±10 %.F160FРисунок 61.

UPLC хроматограмма фракций ИГ после очистки на ВЭЖХ (пик 1 - инсулин-гларгин;пики 2 и 4 – различные примеси (не идентифицировались); пик 3 – примесный дезаргинилгларгин).Элюат ИГ после ОФ ВЭЖХ подвергали тангенциальной ультрафильтрациидля обессоливания и перебуферивания. Для этого его первоначально разбавляли с помощью ВДИ в 4 раза. Сначала сконцентрировали белковый раствордо объема 2,5 л. Затем раствор разбавили в 4 раза ВДИ и продолжили концентрирование до того же объема. Цикл разбавления/концентрирования проводили восемь раз (8 пассажей). После восьмого пассажа белок сконцентрировали до минимально возможного объема раствора. Затем вытеснили белок изсистемы 10 л ВДИ.

Полученный после тангенциальной фильтрации растворбелка филтльтровали стерильно через глубинный фильтр 0,2 мкм, замораживали при -150С и лиофилизировали до сухого состояния (влажность не более10 %).Разработанная технология выделения и очистки ИГ позволила получитьАФС, удовлетворяющую требованиям спецификации (Таблица 20) с общимбиопроцессуальным выходом примерно 70 г / м3 культуральной жидкости.Таблица 20. Результаты контроля качества готовой субстанции ИГ.F161ПоказательМетодСпецификация(Норма)*Полученная АФСБактериальныеэндотоксины, ЭЕ/мгЛАЛ-тестне более 100,96 – 1,92Активность (в пересчете ВЭЖХна сух. вещество), МЕ/мгне менее 27,527,52Содержание ИГ, %ВЭЖХне менее 97,598,73Высокомолекулярныебелки, %ВЭЖХне более 0,30,13Родственные белки, %ВЭЖХне более 20,60Содержание дезаргинилгларгина, %ВЭЖХне более 10,54* Проект фармакопейной статьи предприятия на инсулин-гларгин (Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биоорганической химии им.

академиковМ.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук, Москва).В общем виде технологическая схема процесса может быть представленаследующим образом. Биопроцесс проводят в промышленном ферментере, затем заиндуцированные клетки собирают на сепараторе и дезинтегрируют гомогенизатором Гаулина. Дезинтеграт - ТВ - отмывают буферными растворамии концентрируют сепарацией, центрифугированием или микрофильтрацией.Затем ТВ растворяют в денатурирующем буфере, содержащем мочевину в качестве хаотропного агента и ДТТ в качестве восстановителя.

РастворенныеТВ осветляют микрофильтрацией и рефолдируют выделенный восстановленный белок сорокакратным разбавлением в ренатурирующем буфере. Ренатурат очищают от примесей и концентрируют с помощью анионообменнойхроматографии на колонне с ДЭАЭ-сефарозой. Чистые фракции собирают игидролизуют трипсином. Гидролизат очищают с помощью ВЭЖХ.

Чистыефракции собирают и подвергают ультрафильтрации с целью перебуферирования и концентрирования. Концентрат стерилизуют фильтрацией черезфильтры 0,2 мкм, замораживают и лиофильно высушивают. Схема процессапредставлена ниже (Рисунок 62).F162F163Вода очищеннаяP-152P-125P-152P-125P-125P-125P- 125P-125P-125P-125P-125P-148Емкость срастворомформалина длястерилизацииP-153P-149P-160E-126P-150E-114СепараторЕмкость срастворомглюкозы дляподпиткиE-113P-174E-112Емкость срастворомаммиака длядоведения рНP-356P-352Сепарация клетокE-219P-355E-121P- 183Емкость дляконцентрированныхклетокP-188P-358Емкость для ВДИP- 196E-100Емкость спитательнойсредойE-220Емкость дляутилизацииотходовP- 189P-167Емкость сбуфернымраствором дляотмывки P-211ТВЕмкость сденатурирующимрастворомP-210P-358Емкость для жидкойАФСЕмкость дляконцентратаP-213Мочевина на растворение ТВV-48E-214E-218Стерильная фильтрацияE-215P-361P-175E-125E-122E-133E-134P-353E-216E-101P-355БиопроцессP- 197V-35ФерментерE-141P-157ГомогенизаторГаулинаE-128Лиофильная машинаУльтрафильтрацияP-350E-221E-217E-142P- 199Мочевина на растворение ТВE-143E-118P-165ДезитеграцияP-198P-363Мочевина на растворение ТВГотовая АФС нахранениеP-211E-109P-173E-222Емкость длярастворения ТВМикрофильтрация раств.

ТВМикрофильтрация ТВP- 201E-117P-362P-212Емкость длясуспензии ТВE-131E-129P-220P- 204Емкость дляренатурацииE-138P-209P-224E-139P-218P-229P-217E-145V-39 P-253P-253E-165Основная очисткаХроматографическая очисткаГидролизP-349P-299P-316ВЭЖХколоннаФракции ИГE-193P-232Емкость дляпроведенияферментативногогидролизаE-197E-170P-253P-301Колонна сДЭАЭсефарозойФракции РПP-300E-147E-182E-154E-194P-322P-310P-235P-293P-348E-190P-233E-152E-181P-255P-232P-316P-260P-303P-309P-305E-187P-318P-303Емкости дляготовыхподвижныхфазP-302E-191P-320E-189P-317E-188P-314P-258Емкости дляготовыхподвижныхфазХроматографическаясистемаE-196P-257E-150P-259ХроматографическаясистемаP-260P-275E-166P-274E-167P-273E-168P-272E-169V-41V-44P-269P-321P-307P-312P-315P-267P-265P-266P-306V-45P- 268V-40P-313P-276E-192E-171P-270P-308P-303Емкости дляприготовленияподвижныхфазP-305P-309E-195P-318E-186E-199P-319P-311Емкости дляприготовленияподвижныхфазE-198P-304P-323P-260P-257P-258E-153E-149E-151P-261P- 259P-262E-146P-263P-264Емкость дляутилизацииотходовFВода для инъекцийE-164P-230P-346P-230Рисунок 62.

Схема выделения и очистки ИГ.P-354ЛиофилизацияP-360Емкость дляконцентрирования иультрафильтрацииP-187E-103P-261P-230P-230P-230F1642.7. Подтверждение эквивалентности.В настоящее время рекомбинантные белки широко используются в различных областях науки и медицины. По причине того, что годовой оборот рынкатаких белков уже давно представляет собой как минимум шестизначныецифры, на рынке всё чаще появляются так называемые препараты дженерики. По своей сути они представляют собой воспроизведение оригинальногопрепарата, на действующее вещество которого истек срок патентной защиты.Одним из основных требований к дженерикам является доказанная фармацевтическая эквивалентность.Как уже было отмечено ранее, гларгин относится именно к этому классу препаратов.Для подтверждения структурной эквивалентности гларгина, полученного внашей лаборатории, были выбраны следующие методы:(1).

Метод масс-спектрометрии;(2). Метод пептидного картирования.2.7.1. Метод масс-спектрометрического анализа.Метод масс-спектрометрического анализа основан на разделении ионов исследуемого вещества по величинам m/z (отношение массы иона m к его заряду z) и измерении этих величин.В качестве контрольного образца использовали белок после очистки, образецсравнения - препарат «Лантус» (Sanofi-aventis, Франция).Результат анализа контрольного образца (а) и образца сравнения (б) образцовпредставлен ниже (Рисунок 63а,б). По итогам проведенной работы:Масса контрольного образца (Лантус) – 6054 Да;Масса рабочего образца (гларгин после DS-2) – 6052 Да;Масса Гларгина по спецификации [333]: 6063 Да‑F165Таким образом, в пределах погрешности метода (1%) можно говорить о молекулярно-массовом соответствии коммерческого и разрабатываемого намипрепаратов.2.7.2. Метод Пептидного картирования:В качестве контрольного образца использовали белок после очистки, образецсравнения - препарат «Лантус» (Sanofi-Aventis, Франция).Исследование проводилось по методу пептидного картирования продуктовферментативного гидролиза испытуемого образца протеазой V8 изStaphylococcus aureus, в сравнении с образцом стандарта инсулина-гларгина(«Лантус»), обработанного аналогичным способом.

Характеристики

Список файлов диссертации

Свежие статьи
Популярно сейчас
Как Вы думаете, сколько людей до Вас делали точно такое же задание? 99% студентов выполняют точно такие же задания, как и их предшественники год назад. Найдите нужный учебный материал на СтудИзбе!
Ответы на популярные вопросы
Да! Наши авторы собирают и выкладывают те работы, которые сдаются в Вашем учебном заведении ежегодно и уже проверены преподавателями.
Да! У нас любой человек может выложить любую учебную работу и зарабатывать на её продажах! Но каждый учебный материал публикуется только после тщательной проверки администрацией.
Вернём деньги! А если быть более точными, то автору даётся немного времени на исправление, а если не исправит или выйдет время, то вернём деньги в полном объёме!
Да! На равне с готовыми студенческими работами у нас продаются услуги. Цены на услуги видны сразу, то есть Вам нужно только указать параметры и сразу можно оплачивать.
Отзывы студентов
Ставлю 10/10
Все нравится, очень удобный сайт, помогает в учебе. Кроме этого, можно заработать самому, выставляя готовые учебные материалы на продажу здесь. Рейтинги и отзывы на преподавателей очень помогают сориентироваться в начале нового семестра. Спасибо за такую функцию. Ставлю максимальную оценку.
Лучшая платформа для успешной сдачи сессии
Познакомился со СтудИзбой благодаря своему другу, очень нравится интерфейс, количество доступных файлов, цена, в общем, все прекрасно. Даже сам продаю какие-то свои работы.
Студизба ван лав ❤
Очень офигенный сайт для студентов. Много полезных учебных материалов. Пользуюсь студизбой с октября 2021 года. Серьёзных нареканий нет. Хотелось бы, что бы ввели подписочную модель и сделали материалы дешевле 300 рублей в рамках подписки бесплатными.
Отличный сайт
Лично меня всё устраивает - и покупка, и продажа; и цены, и возможность предпросмотра куска файла, и обилие бесплатных файлов (в подборках по авторам, читай, ВУЗам и факультетам). Есть определённые баги, но всё решаемо, да и администраторы реагируют в течение суток.
Маленький отзыв о большом помощнике!
Студизба спасает в те моменты, когда сроки горят, а работ накопилось достаточно. Довольно удобный сайт с простой навигацией и огромным количеством материалов.
Студ. Изба как крупнейший сборник работ для студентов
Тут дофига бывает всего полезного. Печально, что бывают предметы по которым даже одного бесплатного решения нет, но это скорее вопрос к студентам. В остальном всё здорово.
Спасательный островок
Если уже не успеваешь разобраться или застрял на каком-то задание поможет тебе быстро и недорого решить твою проблему.
Всё и так отлично
Всё очень удобно. Особенно круто, что есть система бонусов и можно выводить остатки денег. Очень много качественных бесплатных файлов.
Отзыв о системе "Студизба"
Отличная платформа для распространения работ, востребованных студентами. Хорошо налаженная и качественная работа сайта, огромная база заданий и аудитория.
Отличный помощник
Отличный сайт с кучей полезных файлов, позволяющий найти много методичек / учебников / отзывов о вузах и преподователях.
Отлично помогает студентам в любой момент для решения трудных и незамедлительных задач
Хотелось бы больше конкретной информации о преподавателях. А так в принципе хороший сайт, всегда им пользуюсь и ни разу не было желания прекратить. Хороший сайт для помощи студентам, удобный и приятный интерфейс. Из недостатков можно выделить только отсутствия небольшого количества файлов.
Спасибо за шикарный сайт
Великолепный сайт на котором студент за не большие деньги может найти помощь с дз, проектами курсовыми, лабораторными, а также узнать отзывы на преподавателей и бесплатно скачать пособия.
Популярные преподаватели
Добавляйте материалы
и зарабатывайте!
Продажи идут автоматически
6417
Авторов
на СтудИзбе
307
Средний доход
с одного платного файла
Обучение Подробнее