Разработка научных основ создания технологии выделения и очистки генно-инженерных белков (1090305), страница 20
Текст из файла (страница 20)
Пределами устойчивости метода являлись результаты определения Sи K, находящиеся в толерантном диапазоне, т.е. в интервале четырех стандартных отклонений (±2σ). Результаты проверки устойчивости SEC анализа кподобным изменениям условий представлены ниже (Рисунок 23).Видно, что ни одно значение S или K не вышло за пределы установленноготолерантного диапазона, таким образом, метод SEC является устойчивым.Однако стоит заметить, что, как упоминалось выше, эффективность колонны(число теоретических тарелок) сильно зависит от концентрации L-аргинина вподвижной фазе, поэтому значительные изменения концентрации L-аргининамогут существенно влиять на анализ.Резюмируем: разработанный метод анализа, основанный на применении колонны, упакованный силикагелем с привитым диольным лигандом, обладаетзначительной эффективностью (ведение цикла определения при скорости0,5 мл/мин; время цикла 25 минут), воспроизводимостью результатов, селективностью определения чистоты мономерной формы РП внутри диапазонаконцентраций РП в образце (2÷8) мг/мл.
Метод основан на элюции легко приготовляемой подвижной фазой, в состав которой входят 25% ацетонитрила,25% уксусной кислоты и 7 мг/мл L-аргинин. Специальное оборудование(градиентный насос и смеситель) не требуется. Метод SEC может быть суспехом применен для внутрипроизводственного контроля предшественникаИГ, а также, в силу отсутствие какой-либо аффинной специчиности, и другихF115белков в диапазоне молекулярных масс, указанной производителем (от 1 до60 кДа)FРисунок 23. Устойчивость метода к изменению температуры (A и B), скорость элюции (C и D), составаподвижных фаз (E и F).1.2.
Растворение ТВ и денатурация РП.В качестве продуцента предшественника ГИЧ использовали бактериальныйштамм Е. coli BL21DE3/pPins07 (Федеральное государственное бюджетноеучреждение науки Институт биоорганической химии им. академиков М.М.Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук). Клетки культи-F116вировали в условиях, обеспечивающих накопление тел включения гибридного белка-предшественника. При культивировании клеток штамма-продуцентагибридного белка для получения инокулята питательную среду на основегидролизата казеина и экстракта пекарских дрожжей засевали культуройштамма-продуцента, затем выращивали посевной материал в ферментереобъемом 20 л.
Полученный материал использовали для засева ферментераобъемом 1000 л. Ферментацию проводили до достижения культурой оптической плотности 15 ОЕ, индуцируя синтез гибридного белка 1-изопропил-β-D1-тиогалактопиранозидом. После окончания ферментации клетки штаммапродуцента гибридного белка (биомассу) отделяли центрифугированием, разрушая на дезинтеграторе Гаулина и выделяя центрифугированием тельцавключения. После окончания стадии ферментации отмытые от осколков клеточных стенок тельца включения солюбилизировали, используя сильные денатуранты (8 М мочевина, 0,5 % об.
гидроксида аммония, рН~12,0). Для разрыва ненативных дисульфидных связей между остатками цистеинов в белке всолюбилизирующий буфер вносили восстанавливающие агенты (10 мМ дитиотреитол) (Рисунок 24).FРисунок 24. Структура процесса денатурации предшественника ИГ.F117Контроль процесса проводили с помощью разработанной нами методики SEC(Рисунок 25): был получен образец с концентрацией 40±4 мг/мл и чистотой58±4 %.FРисунок 25. SEC – хроматограмма денатурированного РП: пик 4 – восстановленный мономер РП,пики 1-3 – димерная и мультимерные формы РП.1.3.
Рефолдинг РП.Рефолдинг РП инициировали снижением концентрации хаотропного агента ивосстановителя методом прямого разбавления буферным раствором. Для этого при перемешивании медленно прибавляли раствор РП в буферный раствор, содержащий 25 мМ трис, рН 10,0-11,0. По окончании смешивания растворов перемешивание в емкости с ренатурантом останавливали и оставлялина холоде (+5 0С) на 24 часа. Одним из критических параметров при ренатурации является концентрация ренатурированного белка. В лабораторныхусловиях процесс проводят при крайне низкой концентрации РП ~10 мкг/млдля предотвращения образования агрегатов, однако в промышленном масштабе крайне неудобно оперировать такими низкими концентрациями.
Поэтому основной задачей был поиск сравнительно высокой концентрации РП,при которой потери из-за агрегации уравновешиваются удобством дальнейшего использования раствора РП высокой концентрации.F118Ренатурацию проводили методом разбавления восстановленного раствора РПразной концентрации от 0,2 до 1,25 мг/мл в буферном растворе 25 мМ трис(Рисунок 26). Как и ожидалось, выход ренатурированного мономера РБ снижался при увеличении исходной концентрации РП за счет образования агрегатов.
При 0,2 г/л был получен ренатурированный РП с содержанием мономера 43,5% и выходом более 70%; при 1,25 г/л выход составил всего 61% присодержании мономера РП 34%. Однако несмотря на хорошие результаты, полученные при 0,2 г/л, данная концентрация слишком низка для промышленного производства, поэтому была выбрана промежуточная концентрация РП0,8-1,0 г/л.FРисунок 26.
Влияние концентрации РП на ренатурацию.В результате рефолдинга был получен раствор ренатурированного мономераРП с содержанием 44±4% и концентрацией 0,9±0,1 г/л, при этом выход составил 83±2% (Рисунок 27).F119FРисунок 27. SEC – хроматограмма денатурированного РП: пик 4 – ренатурированный мономер РП,пики 1-2 – димерная и мультимерные формы РП, пик 3 - неренатурировавший восстановленный мономер РП.1.4. Валидация внутрипроизводственного контроля чистоты мономера РП в растворах методом ПААГЭ.В ходе всех описанных операций образуется ряд примесей рекомбинантногопрепроинсулина, что главным образом связано с протеканием побочных агрегаций. Поэтому растворы целевого мономера предшественника инсулина человека содержат нежелательные мультимерные формы. Обычно для очисткирекомбинантного белка применяют ионообменную хроматографию, необходимую для очистки целевого белка от агрегационных примесей.
Следовательно, необходимо тщательно контролировать протекание процесса хроматографической очистки с тем, чтобы обеспечить максимально эффективноенакопление чистого целевого рекомбинантного белка. Для этой цели былопредложено использовать ПААГЭ. Однако любой метод анализа должен бытьвалидирован для подтверждения того, что он позволяет получать достоверные и воспроизводимые результаты.Для проведения валидации нами была выбрана следующая стратегия:1.
Выбор оптимальной нагрузки при определении содержания мономера рекомбинантного белка.F1202. Выбор оптимальной нагрузки при определении молекулярной массы мономера рекомбинантного белка.3. Определение предела обнаружения рекомбинантного препроинсулина методом ПААГЭ.4. Изучение влияния соли в образцах на качество аналитической процедуры(устойчивость метода).5. Оценка прецизионности (сходимости, внутрилабораторной прецизионности), сходимости и правильности результатов определения молекулярноймассы рекомбинантного белка.6. Оценка прецизионности (сходимости, внутрилабораторной прецизионности), сходимости и правильности результатов определения содержания мономера рекомбинантного белка.Как видно из представленной стратегии валидация проводилась отдельно подвум направлениям: определение содержания целевой мономерной формы имолекулярной массы РП.
Это связано с тем, что для оценки молекулярноймассы (подтверждение подлинности РП) анализ проводился в восстановительных условиях (с добавлением ДТТ и кипячением образцов), а для оценкисодержания мономера такой способ неприменим. Поэтому во втором случаеанализ образцов проводили в условиях, исключающих восстановление.1.
Выбор оптимальной нагрузки при определении содержания мономера рекомбинантного препроинсулина.Решение задачи выбора оптимальной нагрузки при оценке содержания мономера РП сводилось к определению необходимого и достаточного количествабелкового препарата, вносимого в гель, при разделении которого методомПААГЭ получается максимально возможное количество четко различимыхполос, соответствующих отдельным компонентам белковой смеси, для корректной количественной оценки.F121Для этого готовили две серии образцов и их анализировали, нагружая трекиследующим образом (мкг белка в 3 мкл трека): 2; 3; 4; 5; 6; 7; 8.При нагрузках 2; 3; 4 мкг на геле четко видны полосы, соответствующие мономерной и димерной формам белка (Рисунок 28).
Полосы тримера и тетрамера не определяются. Следы тримера и тетрамера появляются при нагрузке5 мкг и более отчетливо проявляются при 6 мкг на лунку. Далее спектр визуально определяемых белковых полос остается неизменным вплоть до 8 мкгна лунку. Нагрузка 6 мкг - минимальная нагрузка, при которой четко различаются 4 области по положению полос, соответствующих мономеру, димеру,тримеру и тетрамеру белка. Следовательно, именно нагрузка, равная 6 мкг,может считаться необходимой и достаточной.FРисунок 28. Электрофореграмма образцов для выбора оптимальной нагрузки при определении содержания мономера РП (а и б - две серии образцов).2.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
