Разработка научных основ создания технологии выделения и очистки генно-инженерных белков (1090305), страница 15
Текст из файла (страница 15)
По этой причине волокнообразование инсулина в кислых средах (т.е. в условиях благоприятныхдля мономеров и/или димеров) происходит быстрее, чем при нейтральномзначении рН.В условиях гель-фильтрационной очистки фибриллярная агрегация проявляется в образовании небольшого переднего «плеча» у хроматографическогопика, соответствующего инсулину (так называемый «fronting») [288, 289].‑‑Это приводит к некоторому снижению выхода процесса очистки (до 10 % потерь). Однако минимизировать процент потерь возможно за счет оптимизации параметров процесса, а именно: высоты столба сорбента в хроматографической колонне, температуры, концентрации наносимого на колонну образца, типа используемого элюента [290].‑Для каждого конкретного генно-инженерного белка спектр родственныхпримесей, возникающий вследствие деградаций, уникален.
Это может бытьокисление, протеолитическая деструкция, дезамидирование по остаткам аспарагина или глутамина и др. Самые проблематичные для «downstream» процесса примеси – дезамидированные формы целевого белка.Методы избавления от дезамидированных примесей лучше всего также рассматривать на примере инсулина. В производстве инсулина проблема дезамидирования стоит настолько остро, что нормативной документацией особенноподчеркивается, что в конечных препаратах количество А21-дезамидоинсулина не должно превышать 2 %.А21-дезамидоинсулин - этот полипептид является производным инсулина,содержащим в 21 положении А-цепи аминокислотный остаток аспарагиновойF83кислоты вместо аспарагина. Образование А21-дезамидоинсулина происходитне только в ходе гидролиза рекомбинантного белка наряду с инсулином; также возможно дезамидирование инсулина, приводящее к образованию А21дезамидоинсулина [291, 292]. Образование А21-дезамидоинсулина из инсу‑‑лина в основном протекает в кислых условиях (Рисунок 16).Показано, что эффективного избавления от А21-дезамидоинсулина можнодостичь только с помощью ОФ ВЭЖХ и причем в очень селективных условиях [257, 258].FРисунок 16.
Капиллярный электрофорез препаратов ГИЧ, выдержанных в кислых условиях (0,1МHCl, рН 2,01) в течение 0, 3, 24 и 41 часа при комнатной температуре. Пик 1 соответствует инсулину,пик 2 – А21-дезамидоинсулину. Условия электрофореза: плавленый кварц, 75 µm I.D., 37,5 см до детектора, 50 см общей длины; напряжение 15 кВ; подвижная фаза: 50мМ борат натрия (рН 8,0) – 30%этиловый спирт.4.5. Валидация процессов выделения и очисткиПосле разработки подхода и оптимизации выделения и очистки генно-инженерных белков, процесс необходимо валидировать. А именно, выполнениемряда проверок должно быть подтверждено, что все процессы, составляющиетехнологию получения белка, воспроизводимо и предсказуемо отвечают назначенным целям [293].‑Валидация процесса позволяет в первую очередь оценить его способностьвоспроизводимо и предсказуемо достигать результатов, как-то: заданной производительности и необходимого качества продукта. Для этого первоначаль-F84но определяются критические параметры, которые вносят определяющийвклад в процесс выделения и очистки.
Эти критические параметры могутбыть заданы по условию осуществления процесса (параметры «на входе»)или могут быть получены в качестве результата осуществления процесса (параметры «на выходе»). Для валидации процесса параметры «на входе» следуют менять в допустимых пределах и оценивать изменение параметров «навыходе» (Таблица 8). Параметры «на выходе» оцениваются в соответствии сзаданными критериями приемлемости: если параметры не выходит за диапазон критерия приемлемости, то можно считать процесс валидным; а если параметры в той или иной мере превышают пределы критериев приемлемости,то условия проведения такого процесса должны быть пересмотрены, то естьдолжны быть иначе заданы параметры «на входе».Таблица 8. Примеры параметров процесса хроматографии "на входе" и "на выходе".Параметры«на входе»рН, температура, ионная сила, нагрузка, скорость потока,время удержания«на выходе»Чистота, концентрация, стабильность, выход, содержаниеДНК, содержание эндотоксинов, содержание вирусов,давление в системеПримером валидации процесса может служить работа М.Дегермана, в которой предложена перспективная описательная модель препаративного хроматографического разделения инсулина и А21-дезамидоинсулина [294].
Кон‑струирование этой модели включает калибровку параметров элюции (градиента концентрации этанола в качестве органического модификатора подвижной фазы) и нагрузки вещества на колонну. Параметры элюции математически описываются с помощью критерия Пекле (Формула 1).JPe =ν ⋅dpDAXФормула 1F85гдеν - линейная скорость потока;dp - приведенный размер частиц сорбента;Dax - коэффициент дисперсии.Параметры нагрузки выводятся, основываясь на кинетической модели Ленгмюра (Формула 2) [295].‑b=гдеJL f (tr − to )Формула 2nmnm - количество наносимого на колонну образца;Lf - фактор нагрузки;tr - время удержания ГИЧ;to - время выхода неудерживаемых компонентов;b - константа равновесия ЛенгмюраВытекающими из математических следствий модели критериями были: скорость производственного цикла, чистота и выход основной фракции. Результаты калибровки модели позволили автору оптимизировать параметры элюции и нагрузки и валидировать процесс хроматографического разделения инсулина и А21-дезамидоинсулина.
Подход, описанный в этой работе, требуетгромоздких математических обоснований и, как следствие, решения специальными компьютерными функциями (автор использовал алгоритм fminconпроцессора MatLab [296]).‑Иной способ перспективной валидации процесса очистки биофармацевтических веществ описан А.Пончином [297]. Метод основан на проведении серии‑процессов в наихудших условиях (старый сорбент, не до конца проведеннаярегенерация и т.д.) и оценке приемлемости получаемых результатов заданным критериям (чистота, время цикла, выход).
Метод назван FMOE (FailureMode Effect Analysis), или анализ влияния граничных условий валидности.F86Такой подход позволяет однозначно определить диапазон валидности процесса, а также оптимизировать некоторые его параметры с помощью математических процессоров (например, Design Expert Software).Интересный подход к конкурентной валидации процесса хроматографической очистки нуклеозидов описан Р.К.Р.Родригесом [298]. Производственное‑проведение хроматографии в режиме SMB (simulated moving-bed, или симулирование движения сорбента) масштабировано до аналитического (scaledown). Модель, описывающая процесс массопереноса в ходе хроматографии,была валидирована на основе воспроизведения данных шести последовательных циклов очистки.
Действующая производственная схема процессабыла признана валидной, т.к. после масштабирования результаты также воспроизводились.Для подтверждения воспроизводимости и предсказуемости процесса, ондолжен быть проведен на валидированном оборудовании в заранее установленных условиях как минимум три раза [299]. Если все последовательные се‑рии воспроизводятся и отвечают всем критериям приемлемости, то процессможно считать валидным.
Во многих случаях возможно проведение процессав «наихудших условиях» для подтверждения того, что он будет удовлетворятьвсем заданным критериям даже в критических ситуациях. Однако, валидацияпроцесса всегда очень трудна: либо необходимо пользоваться сложными математическими моделями (в случае перспективного или конкурентного подходов), либо наблюдать за процессом длительное время, с тем, чтобы бытьуверенным, что результаты воспроизводимы и предсказуемы (в случае ретроспективного подхода).5.
Примеры выделения и очистки значимых биофармацевтических белковДля того, чтобы установить закономерности и выявить научные основы процессов выделения и очистки генно-инженерных белков, рассмотрим ряд при-F87меров – стратегически важных объектов, ставших «китами» на фармацевтическом рынке.5.1. Производные инсулинаИнсулин – полипептидный гормон, вырабатываемый β-клетками островковЛангерганса поджелудочной железы. Инсулин выполняет в организме важные функции контроля метаболизма и гомеостаза глюкозы, оказывая влияниена экспрессию большого числа генов, вовлеченных в эти процессы [300].
Де‑фицит инсулина может быть вызван разнообразными факторами, сопровождается развитием тяжелых патологических состояний организма, характеризующихся повышением уровня глюкозы в плазме крови, получивших название диабета. По данным Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ), более 340 млн человек во всем мире больны диабетом.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
