Разработка научных основ создания технологии выделения и очистки генно-инженерных белков (1090305), страница 10
Текст из файла (страница 10)
Улучшение способности клеток биосинтезировать белки с требуемымипосттрансляционными модификациями;(2). Увеличение выживаемости и метаболической активности клеток, минимизируя апоптоз.Для производственных целей требуются высокопролиферативные клетки, которые способны к быстрому росту и жизни в высокой клеточной плотности.За периодом роста следует производственная фаза, во время которого клеточная плотность поддерживается на одном уровне за счет ингибирования апоптоза. Для регуляции уровня апоптоза и минимизирования его подходят циклин-зависимые киназы (CDK), которые могут контролировать многие процессы жизненного цикла.
Их активность регулируется путем связыванияCDK с циклинами и образованием комплексов (после фосфорилирования) сциклин-зависимыми ингибиторами семейства CIP/Kip, такими как p21, p27 иp57 [181, 182, 183]. Таким образом, сверхэкспрессия p21cip и p27kip приводит‑‑‑к остановке G1 фазы жизненного цикла (к связанному с этим наращиваниюмитохондриальной массы и увеличению рибосомального биогенеза), к своегорода отмене следующей стадии – смерти, и как следствие – к существенномуповышению продуктивности клеток [184].‑Все промышленные линии клеток: и СНО, и миеломы, и гибридомы, иHEK293 - в состоянии выживать при высокой клеточной плотности, и, еслиF55бы не апоптоз, промышленное производство даже крупномасштабных проектов могло бы происходить в малых объемах сред.
Таким образом, снижениеуровня апоптоза может очень сильно сказываться на рентабельности технологии эукариотической экспрессии.Еще одной попыткой решения этой проблемы является семейство белков Bcl2. В него входят антиапоптические и проапоптические белки, многие из которых ассоциированы с митохондриями. Антиапоптические белки входят в состав мембран митохондрий и предотвращают высвобождение cyt c, цитотоксического белка.
Сверхэкспрессия Bcl-2 может приводить к задержке клеточного апоптоза, что, конечно, сильно сказывается на продуктивности в лучшую сторону [185, 186]. Справедливости ради стоит отметить, что подобного‑‑эффекта ингибирования апоптоза, по сообщению многих источников, можнодобиться путем простых манипуляций с составом питательных сред [187,‑188, 189].‑‑Другие стратегии повышения титра целевого генно-инженерного белка вкультуральной жидкости фокусируются на увеличении уровня трансгеннойэкспрессии. Под этим понимается вовлечение в трансгенные конструктыДНК элементов, которые либо могут действовать как усилители-энхенсеры,либо могут предотвращать обратное воздействие на подавление экспрессиитрансгена при интеграции в геноме.
Примером может служить технологияSTAR (stimulating and antirepressing elements, или стимулирующие и антирепрессирующие элементы) от компании Crucell: элементы ДНК, которые используются для остановки негативного подавления экспрессии путем интеграции специальных генно-инженерных конструкций в гетерохроматин. Этоувеличивает стабильность клеточной линии, а следовательно, продуктивность, одновременно уменьшая число клонов, которые приходится подбиратьскринингом [190, 191, 192]. Использование искусственных хромосом (напри‑‑‑мер, система ACE от компании Chromos Molecular Systems Inc., Канада), действующих как стабильные, неинтегрирующие векторы с большой несущейемкостью, способных мультиплицировать копии одного трансгена, могутпривести к четырехкратному увеличению уровня экспрессии обычной СНО-F56DHFR культуры [193].
Также сообщалось, что трансгенная экспрессия может‑быть повышена путем усиления трансгенного промотора синтезированнымитранскрибирующими факторами, которые связывают последовательностьДНК с ним [194].‑Подводем итоги. Успешность стадии разработки и оптимизации эукариотического биосинтеза целевого генно-инженерного белка в биофармацевтике зависит от следующих ключевых факторов: качество и биобезопасность продукции, скорость наработки материала для клинических испытаний, экономичность разрабатываемых процессов и совместимость с регуляторной, нормативной документацией. В случае с разработкой клеточных линий животного происхождения эти факторы играют еще большую роль. На сегодняшниймомент наиболее успешными кандидатами для биофармацевтического производства терапевтических гликозилированных белков остаются клетки млекопитающих, наиболее популярными из которых являются СНО и мышиныемиеломы.Соответственно, наиболее значимые факторы, определяющие оптимальныйвыбор той или иной экспрессионной системы: продуктивность, экономичность, биобезопасность, масштабируемость, легкость квалификации и валидации.
Причем, очевидно, что на стадии R&D самое большое внимание уделятся последним показателям, в то время как на производственном уровненаибольшую важность приобретает продуктивность.В случае гликозилированных белков уровень экспрессии определяется главным образом конструкцией промотора, копийностью его гена и интегрированностью в хромосомном аппарате. Объемная продуктивность зависит отспецифической продуктивности и скорости роста клеток. Именно объемнаяпродуктивность влияет на конечный выход всего «upstream» процесса.
Крометого, специфическая продуктивность и плотность клеток в культуре, конечно,определяют размер биореактора, масштаб процесса. Лучше всего продемонстрировать это на примере двух клеточных линий с различной объемной продуктивностью (Таблица 5).F57Таблица 5. Сравнение двух клеточных линий с различной объемной продуктивностью (расчет исходяиз масштаба 10 кг белка; перфузионный режим культивирования).СНОPER.C6Специфическая продуктивность, пкг/клетка*день1515Макс.
клеточная плотность, *1010100Объемная продуктивность, мг белка/л среды1501500Выход «downstream» процесса, %5050Финальный продукт после очистки, кг1010Продукт на очистку, кг2020Объем культуральной жидкости, л133,33 13,333Количество ферментация в 50л реакторе1079Количество ферментаций в 100л реакторе534Количество ферментаций в 250л реакторе212Количество ферментаций в 500л реакторе111Представим себе последовательно-непрерывное перфузионное культивирование двух различных продуцентов с одинаковой специфической продуктивностью, но способных выживать в условиях с различной (в 10 раз) клеточнойплотностью.
В качестве стандартного титра примем специфическую продуктивность равной 15 мкг белка с клетки за день. Клеточная плотность линииPER.C6 в десять раз выше, чем плотность СНО. Очевидно, что PER.C6 будетпроизводить белка с объемной продуктивностью также в 10 раз более высокой.Приняв во внимание одинаковую потребность в конечном продукте (10 кгАФС) и выход с «downstream» процесса также одинаковый (50 %) в обоихслучаях, нетрудно рассчитать, что при культивировании в стандартном промышленном биореакторе объемом 500 л потребуется 11 ферментаций (цикловкультивирования) для получения заданных 10 кг АФС в случае СНО-клеток,и только 1 ферментация в случае более производительной PER.C6.Или, с другой стороны, при тех же самых потребностях и выходах процессапонадобится иметь 50-литровый биореактор для культивирования PER.C6 (иF58провести 9 циклов), в то время как для СНО-клеток нужен существенно более дорогой и сложный в обращении 500-литровый биореактор (и, соответственно, даже большее количество циклов – 11).
Кроме того, еще следуетучесть десятикратную экономию дорогостоящих питательных сред.Под качеством продукта в случае эукариотической экспрессии в основномпонимают корректность посттрансляционных модификаций (гликозилирования) и корректность третичной структуры (фолдинг), которые в совокупностибудут определять финальную биологическую активность АФС. Несмотря нанекоторые различия, большинство клеток млекопитающих обеспечивают иоптимальное гликозилирование, и оптимальный фолдинг [195].‑На качество гликозилирования и фолдинга определяющее влияние имеютферментативные системы продуцента и условия культивирования в биореакторе [196]. Таким образом, именно на этапе R&D следует точно определить и‑стандартизировать выбранную систему продуцента и условия культивирования.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
