Разработка научных основ создания технологии выделения и очистки генно-инженерных белков (1090305), страница 5
Текст из файла (страница 5)
Вязкость цитоплазмы.FРисунок 4. Тела включения рекомбинантного белка гормона роста (а) и интерферона-бета (б).Поэтому получение многих терапевтических белков именно в виде ТВ является рентабельным и используется в промышленном масштабе [28, 29, 30].‑‑‑Благодаря исследованиям процессов ренатурации (рефолдинга) белков из ТВстало возможным производить большие количества аутентичных человеческих белков для терапевтических целей, например человеческие инсулин игормон роста. Для этих белков разработано, описано и запатентовано большое количество экспрессионных систем на основе E.coli. При создании и оптимизации условий высокопродуктивных экспрессионных систем необходимо учитывать некоторые критерии:а) стабильность мРНК [31];‑F27б) эффективность транскрипции [32] и трансляции [33];‑‑в) скорость образования ТВ;г) подверженность продукта протеолизу [34, 35].‑‑Эти критерии индивидуальны для каждого продукта.
Ниже представлены некоторые примеры высокоэффективных экспрессионных систем для получения терапевтических рекомбинантных белков (Таблица 2). В большинствеслучаев биосинтезированные белки находятся в нерастворимой форме. Рядчеловеческих белков, продуцируемых в E.coli напрямую, а именно гормонроста, интерферон-γ, интерлейкин-2 и др., а также гибридные белки проинсулина, кальцитонина и др., могут присутствовать в клетках как в виде агрегатов, так и в виде ТВ [23].Таблица 2. Высокоэффективные экспрессионные системы терапевтических рекомбинантных белков вE.coli.ТипэкспресииУровеньэкспрессии(% от общегобелка)hEGFгибридинсулин человекаРекомбинантныйбелокПродуктивность(мг/лкультуральнойжидкости)ПромотерОбразование ТВне определено 60trp+гибрид20lac+Инт-βнапрямуюне определено 20trp-Инт-γнапрямую40не определеноtrp+проурокиназачеловеканапрямую6не определеноtrp+hGHнапрямую.не определено 169trp+hGHсекреция 1425/АphoA-hIGF-Iгибрид201240trp+hIGF-Iсекреция 308500phoA+кальцитонинчеловекагибридне определено 478lac+hG-CSFпроизводныенапрямую15trp+не определено2800F28hIL-2напрямую20700trp+hIL-6напрямую20не определеноtrp+глюкагон человекагибрид34,542trp+гирудингибрид18200trp+гирудинсекреция не определено 1000trp-аhEGF - эпидермальный фактор роста человека; Инт - интерферон человека; hGH гормон роста человека; hIGF-I - инсулино-подобный фактор роста-I человека; hG-CSF гранулоцит-стимулирующий фактор человека; hIL - интерлейкин человека.Попытки скоррелировать образование ТВ с определенными свойствами рекомбинантных белков или экспрессионных систем не увенчались успехом[36].
Склонность белков образовывать нерастворимые агрегаты не соотно‑сится с их характеристиками, такими как размер продуцируемых полипетидов, тип гибридной конструкции, субъединичная структура и относительнаягидрофобность рекомбинантного белка [37, 38].‑‑Сверхпродуктивность сама по себе, а именно быстрое увеличение концентрации образующейся полипептидной цепи, является достаточно сильнымфактором при образования неактивных агрегатов, что было показано при исследовании экспрессии гомологичных цитозольных белков [39]. На основе‑полученных данных была предложена кинетическая модель, согласно которой выход нативного белка зависит только от скорости фолдинга, скоростиагрегации и скорости синтеза белка [40].
Эта модель подразумевает, что вы‑ход нативного белка увеличивается с уменьшением скорости экспрессии засчет снижения скорости агрегации. Данное предположение хорошо согласуется с экспериментальными результатами, демонстрирующими, что при ферментации в затруднительных условиях роста (при пониженной температуре,крайних значения рН, специфических культуральных средах) и ограниченнойиндукции увеличивается выход нативного, растворимого рекомбинантногобелка [41, 42].‑‑F29Очень медленный фолдинг рекомбинантного белка должен препятствоватьобразованию ТВ.
Медленный фолдинг характерен для цитозольной экспрессии различных белков, содержащих в нативном состоянии дисульфидные связи. Большая часть секреторных белков содержит дисульфидные связи, в товремя как внутриклеточные белки чаще всего их лишены, хотя и могут содержать цистеин в своем составе [43]. При исследованиях in vitro обнаруже‑но, что нативные дисульфидные связи могут образовываться в восстановительных условиях цитозоля [44], однако с крайне медленной скоростью. Для‑обеспечения окислительного фолдинга при цитозольной экспрессии белков сдисульфидными связями разработано большое количество мутантных штаммов E.coli с пониженной активностью тиоредоксинредуктазы [45].‑Для обеспечения корректного фолдинга, сопровождающегося образованиемдисульфидных связей, используется периплазматическая экспрессия [46, 47,‑‑48]. Периплазматическое пространство E.coli обеспечивает окислительные‑условия, необходимые для образования дисульфидных связей.
Более того, впериплазме E.coli содержатся тиол-дисульфидные изомеразы, которые вовлекаются в процесс образования дисульфидных связей периплазмических илисвязанных с мембраной белков [49]. В отличие от секреторных эукариотиче‑ских белков, которые могут содержать многочисленные дисульфидные связи,прокариотические белки E.coli содержат лишь несколько дисульфидных связей. Следовательно, действие изомераз периплазма E.coli недостаточно длякатализа образование дисульфидных связей в эукариотичеких белках с большим числом таких связей. Вследствие этого происходит образование ТВ припериплазматической экспрессии подобных белков.ТВ, образующиеся при цитозольной суперэкспрессии рекомбинантных белков, представляют собой большие частицы преимущественно сферическойформы.
При крайне высоких уровнях экспрессии они могут достигать размеров, сопоставимых с внутренним диаметром клеток E.coli.Т.к. ТВ имеют более высокую относительную плотность, то они могут бытьвыделены после лизиса клеток при помощи центрифугирования даже присредних скоростях вращения ротора [50]. Для предотвращения их седимента‑F30ции вместе с остатками клеток, необходимо обеспечивать максимально эффективный лизис. Этого можно достичь при помощи дисперсии клеток привысоком давлении с последующей обработкой лизоцимом, растворами солейс высокими концентрациями и различными детергентами, такими как TritonX-100 [51].
Максимальное разрушение клеток достигается при многократном‑повторении вышеописанных процедур [52]. Гомогеность выделяемых тел‑включения можно также обеспечить при использовании хаотропных агентов(мочевина, гуанидин-гидрохлорид) в низких молярных концентрациях нарядус детергентами [53]. В некоторых промышленных схемах тела включения вы‑деляются из культуральной среды при одновременном добавлении восстанавливающего и хаотропного агентов, например цистеина и мочевины [54].‑Предварительная обработка лизоцимом и ЭДТА перед гомогенизацией такжеоблегчает разрушение клеток [55].‑При достаточно высоком уровне экспрессии ТВ получают из культуральнойсреды методом фазового разделения. Некоторые примесные белки клеток хозяина (такие как белки теплового шока, белки наружных мембран) могут накапливаться при выделении ТВ и осаждаться вместе с ними [56].
Например,‑ТВ β-лактамазы содержат в зависимости от экспрессионной системы и условий роста 35-95 % целевого белка, 5-50 % других полипетидов, 0,5-13 %фосфолипидов и следовые количества нуклеиновых кислот [57]. Однако,‑большая часть примесей, содержащихся в ТВ, попадает туда как раз из-за неполного удаления макрочастиц клеток хозяина.Таким образом, образование ТВ, которое часто считается нежелательнымпроцессом, можно также рассматривать и как положительное явление, поскольку происходит концентрирование целевого белка уже на ранних стадияхочистки.Хотя белки ТВ могут содержать относительно большие участки со вторичнойструктурой [58, 59], они практически не растворяются в физиологических‑‑условиях.
Для растворения ТВ в основном используются сильные денатурирующие агенты, такие как гуанидин-гидрохлорид или мочевина. Лучшие результаты были получены при использовании гуанидин-HCl по двум причи-F31нам. Во-первых, гуанидин-HCl является более сильным хаотропным агентом,поэтому в нем растворяются ТВ, плохо растворимые в мочевине. Во-вторых,в растворах мочевины образуется некоторое количество изоцианата [60], что‑приводит к карбомоилированию свободных аминогрупп в белке, особеннопри длительном пребывании в щелочной среде [61]. Поэтому при использо‑вании мочевины рекомендуется добавлять в раствор соединения со свободными аминогруппами.
В некоторых случаях удается растворить ТВ при крайних значениях рН в присутствии низких концентраций денатурантов или вообще без них [62, 63, 64]. Однако крайние значения рН могут привести к не‑‑‑обратимым модификациям белка, например дезамидированию или щелочному десульфидированию остатков цистеина [65].‑В качестве альтернативы мочевине и гуанидин-гидрохлориду предлагаетсяиспользовать также сильные ионные детергенты, такие как SDS [66], N-цети‑лтриметиламмоний-хлорид [67, 68] и саркозил (N-лаурилсаркозил натрия)‑‑[69]. Мочевина и гуанидин-гидрохлорид приводят к «разворачиванию» моле‑кулы белка; принцип действия детергентов еще не изучен в достаточной степени.
Однако с уверенностью можно сказать, что белки, растворенные припомощи детергентов, имеют более упорядоченную структуру, чем растворенные с использованием мочевины или гуанидин-гидрохлорида [70]. Растворы‑ТВ в денатурантах, как правило, прозрачные, неопалесцирующие, однако втаких растворах может происходить олигомеризация белка. Несмотря на то,что в настоящее время достаточно мало известно об агрегации белков в растворах денатуранта, ионные детергенты считаются наиболее действеннымидля получения белков ТВ в мономерном состоянии из-за сильного электростатического отталкивания детергент-белковых комплексов [71].‑Мочевина и гуанидин-гидрохлорид обладают различной связываемостью сбелками в зависимости от концентрации (Рисунок 5). В большинстве случаевнеобходимо использовать 6-8 М мочевину или 6-7 М гуанидин-гидрохлориддля достижения связываемости детергента с белком, необходимой для егорастворения.
Однако даже при высоких концентрациях этих хаотропныхагентов могут происходить внутри- и межмолекулярные взаимодействия [72].‑F32Такие ненативные структуры могут приводить к агрегации и некорректномусворачиванию (мисфолдингу) при последующем удалении денатуранта. Вслучае с детергентами дело обстоит иначе. Связывание детергента с белкомобуславливается критической концентрацией мицеллообразования (ККМ).Только при концентрациях выше ККМ происходит мицелло-подобное связывание с белками, которые в данных условиях легко растворимы, в то времякак при концентрациях ниже ККМ растворимость белка значительно понижается [73].‑JРисунок 5.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
