Разработка научных основ создания технологии выделения и очистки генно-инженерных белков (1090305), страница 3
Текст из файла (страница 3)
Оценить пригодность разработанных технологий путем сравнения качества получаемых продуктов с требованиями спецификаций на АФС.F13ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР1. Биофармацевтическая промышленность: базис и надсройкаРазвитие с середины 1970-х годов генной инженерии, т.е. технологии получения рекомбинантных ДНК, значительно изменило характер исследований,проводимых в области генетики, биологии развития и эволюции.
Разработкаметодов клонирования ДНК и проведения полимеразной цепной реакциипозволяют получать в достаточном количестве необходимый генетическийматериал, включая рекомбинантные (гибридные) ДНК. Эти методы используются для выяснения тонкой структуры генетического аппарата и отношений между генами и их специфическими продуктами – полипептидами. Вводя в клетки рекомбинантную ДНК, удалось получить штаммы бактерий, способные синтезировать важные для медицины белки, например человеческийинсулин, гормон роста человека и многие другие соединения.Развитие современной фармакологии невозможно представить без открытияновых препаратов, получаемых с помощью методов генетической инженерии.Успехи медицины сегодняшнего дня все более базируется на активном применении белковых препаратов, полученных с помощью технологии переносанаследственной информации (генов) из одного организма в другой.
Цельюэтой операции является, как известно, использование возможностей организма нового хозяина к считыванию этой генетической информации и трансформации ее в белковый продукт. Способность производства заданного полипептида (его биосинтез) является определяющей в выборе нового хозяинаи условий его культивирования. Возможность экспрессировать чужеродныегены в клетках различных организмов (как эукариотических, так и прокариотических) стала по сути одним из революционных событий последних двухдекад ХХ столетия, заложила основы современной биотехнологии и явиласьфундаментом самостоятельной отрасли науки – молекулярной биотехнологии. Причем первые практические успехи, достигнутые с помощью технологии рекомбинантных ДНК, относятся к области молекулярной эндокринологии.
В 80-ые годы прошлого столетия компании Genentech первой удалосьF14получить генно-инженерный инсулин человека в новом хозяине, прокариотической клетке кишечной палочки (E. coli) [4].‑Сегодня продуцентами белков, актуальных для медицины и сельского хозяйства, могут выступать бактериальные, дрожжевые, растительные и животныеклетки. Каждый из этих типов продуцентов имеет как положительные, так иотрицательные стороны (Таблица 1).Революционное продвижение рекомбинантных белков человека на фармацевтический рынок связано в большинстве случаев с невозможностью их получения из человеческого материала в достаточном количестве, а замена их животными аналогами, применявшеяся ранее, во многих случаях приводила кнежелательным иммунным реакциям и побочным эффектам [5].
Кроме того,‑возникшие в последние годы ограничения на использование препаратов, полученных из плазмы крови доноров или из трупного материала, связаны спроблемами вирусных и прионных контаминаций [6,7].‑‑Первое особенно касается препаратов крови. Разработка и применение тестсистем для детекции гепатитов и ВИЧ удорожает эти относительно дешевыепрепараты и делает их уже сравнимыми по стоимости с белками, произведенными с помощью технологий рекомбинантных ДНК. При этом необходимо отметить, что некоторые генно-инженерные белковые препараты являютсяпрактически незаменимыми в онкологии и при лечении аутоиммунных процессов.
В первую очередь это относится к антителам, цитокинам, поверхностным опухолевым антигенам, молекулам адгезии. Современные схемылечения ревматоидного артрита, рака груди и шейки матки невозможно представить без применения таких препаратов как, например, ремикейд [8] и гер‑цептин [9]. Тем не менее, на пути создания рекомбинантных белковых лекар‑ственных средств стоит еще много трудностей как фундаментального, так иорганизационного характера.F15Таблица 1. Биофармацевтические продуцентыПродуцентПреимуществаНедостаткиПредставителиБактерииБыстрый ростОтсутствиеEscerichia coliЛегкость контроляпосттрансляционныхStreptomycesэкспрессиимодификацийBacillusВысокаяБиологическая активностьCaulobacterпродуктивностьи иммуногенность могут не crescentusБольшойсоответствовать нативномупрактический опытбелку (биосинтез черезработыгибридныйНизкая/средняяпредшественник)стоимостьНаличие эндотоксиновLactobacillus zeaeсодержанияДрожжиБыстрый ростНе всегда корректныеSaccharomycesОтсутствиепосттрансляционныеcerevisiaeэндотоксиновмодификацииPichia pastorisНизкая/средняяБиологическая активностьстоимостьможет не соответствоватьсодержаниянативному белкуСложный контрольэкспрессии геновРастенияОтносительнаяМедленный ростNicotiana tobaccoлегкость выделенияНизкая продуктивностьNicotianaбелкаСложный контрольbenthamianaОтсутствиеэкспрессии геновChlamydomonasэндотоксиновНекорректный профильreinhardtiiЭкологичность игликозилированиявируснаябезопасностьЖивотныеВозможностьМедленный ростChinese hamsterбиосинтеза сложныхВирусная опасностьovary (CHO)*молекулСложность выделенияBaby hamster kidneyПравильныебелка(BHK)**посттрансляционныеВысокая стоимость293T***модификациисодержанияНЕК-293***F16Продуцент*ПреимуществаНедостаткиЯйцеклетки китайского хомяка, или серого хомяка Cricetulus griseus (эпителий).** Почечные клетки хомяка (фибробласты).*** Эмбриональные почечные клетки человека.ПредставителиF17Общая стратегия развития современной молекулярной биологии, биохимии,микробиологии обеспечивает создание новых векторов для переноса генетической информации, разработку штаммов усовершенствованных прокариотических клеток, дрожжей, способов поддержания перевиваемых культурклеток млекопитающих, эффективных схем очистки рекомбинантных белкови методов промышленной биотехнологии с использованием крупномасштабных биореакторов.
На сегодняшнем этапе развития медицинской биотехнологии резервы использования прокариотических клеток-хозяев практически исчерпаны. Новые, наиболее востребованные продукты, такие как гликопротеины большой молекулярной массы, трудно производить в E. coli в биотехнологически оправданных количествах. Для обеспечения своей функциональной активности они требуют адекватной посттрансляционной модификации. В этой связи на повестку дня поставлен вопрос использования эукариотических клеток млекопитающих. В частности, это относится к терапевтическим антителам, факторам свертывания крови, молекулам адгезии.
Переходот микроорганизмов к культурам животных клеток удорожает производствобелковых продуктов на порядки. Однако все промышленно-развитые странымира активно включились в эту биотехнологическую гонку, и пошли по путисоздания национальных и транснациональных исследовательских и промышленных центров [10].‑Пожалуй, самой большой трудностью работы с генно-инженерными белкамии продвижения их фармацевтический рынок является вопрос биологическойбезопасности. Белковая молекула, произведенная в чужеродном продуценте,может быть выделена с примесями, в том числе с фрагментами ДНК клеткихозяина, ее белками, полисахаридами и эндотоксинами, а также вирусами.Применение препаратов с подобными контаминациями чревато серьезнымиосложнениями [11].‑Таким образом, промышленные технологии производства терапевтическихЛС на основе генно-инженерных белков должны включать не только этапынаработки вещества продуцентом и последующие механизмы извлечения изних, но и стадии избавления от примесей.
Организации выделения и очисткиF18– это две разные и сложные задачи. С одной стороны, необходимо осознать ичетко представлять те примеси, которые являются сопутствующими целевомубелку в технологии, а также те максимально допустимые уровни этих примесей, которые могут быть в финальных АФС и ГЛС. С другой стороны, крайневажно разрабатывать максимально эффективные технологии очистки от этихпримесей.Таким образом, можно выделить три основных базиса, на которых покоитсясовременная методология биофармацевтической промышленности:(1).
Реализация стратегии производства и создание спецификации на конечный продукт, включающей параметры качества, которым должен соответствовать конечный продукт.(2). Выращивание клеток продуцента, инициирование (индукция) биосинтезацелевого генно-инженерного белка.
Это так называемый этап «upstream»процесса.(3). Многостадийная очистка с целью максимально эффективного сниженияуровня примесей – «downstream» процесс.(4). Организация системы обеспечения качества продукции, которая начинается с создания регламента, включающего не только подробное описание этапов «upstream» и «downstream» процессов, но и методики внутрипроизводственного контроля и контроля качества полупродуктов и конечного продукта.Наиболее полно механизм создания спецификации на продукт биологическойи биотехнологической природы описан Международной Конференцией поГармонизации [12].‑Примеси биофармацевтических объектов могут быть процессуальными (возникшими в ходе процессов биосинтеза, выделения и очистки) или родственными (возникшими в ходе химических и биохимических превращений, в ходехранения – продукты деградации).Процессуальные примеси могут быть трех типов:F19(1).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
