Разработка научных основ создания технологии выделения и очистки генно-инженерных белков (1090305), страница 13
Текст из файла (страница 13)
Например, введение 45 мМ Ca2+ в раствор, содержащий 85 мкг/мл гемоглобина, загрязненного эндотоксинами в концентрации 5 мкг/мл, способствовало образованию крупных везикул ЛПС, которые были отделены с помощью ультрафильтрации (финальное содержаниеэндотоксинов в растворе гемоглобина составило 6 пг/мл) [242].‑Это же свойство, очевидно, можно использовать для удаления эндотоксиновметодом гель-фильтрации. Стабилизованные бивалентными катионами везикулы должны элюироваться раньше, чем белки.
Однако положительно заряженные белки могут электростатически связываться с ЛПС, что обычно резкоуменьшает эффективность очистки [243].‑2. Двухфазная экстракция. Этот метод основан на использовании детергентовв концентрациях, превышающих их критические концентрации мицелообразования.
Неполярные взаимодействия между детергентом и липидной частьюэндотоксинов приводят к образованию мицеллярных структур. Агрегирован-F72ные мицеллы при температурах выше точки мицелообразования содержат незначительное количество воды и представляют собой отдельную фазу, в которую вовлечена большая часть эндотоксинов от общего содержания.
Такиемицеллы могут быть отделены с помощью центрифугирования. Экстракциюпри необходимости повторяют до тех пор, пока содержание эндотоксинов врастворе белка не окажется ниже требуемой величины [244, 245].‑‑Для двухфазной экстракции чаще всего используются неионогенные детергенты ряда «Тритон». Например, точка мицелообразования Тритона Х-114составляет +220С, поэтому смешение раствора белка, обогащенного эндотоксинами, и детергента проводят при пониженных температурах (+50С), а принагревании смеси до температур выше +220С образуются две фазы, далееразделяемые центрифугированием.Двухфазная экстракция позволяет снизить содержание ЛПС на несколько порядков, при этом не вызывая денатурации белка и не снижая его активность.Недостатком метода является то, что водная, обогащенная белком, фаза содержит некоторое количество детергента, которое сложно контролироватьметодами анализа.
Более того, сообщалось, что остаточный детергент в растворе белка значительно затрудняет проведение SDS-PAGE и LAL-тестов[246]. Таким образом, необходимо дополнительно вводить в процесс стадию‑гель-фильтрации для избавления белка от следов детергента. Необходимотакже отметить, что разделение образующихся фаз методом центрифугирования проходит достаточно плохо. Так, например, 4000-5000 g оказывается недостаточно для эффективного разделения: нижняя, осажденная гелеподобнаяфаза при неосторожном движении сразу же смешивается с верхней фазой.Очевидно, что такая методика не может быть использована в промышленныхусловиях.Ионообменная хроматография. Рекомбинантные белки, выделяемые из культуральной жидкости штамм-продуцентов чаще всего в форме тел включения,содержат значительное количество эндотоксинов клеточной стенки.
Дляочистки таких белков используются методы ионообменной хроматографии.F73Важно помнить, что рН подвижной фазы должен быть ниже изоэлектрической точки очищаемого белка, но выше рКа эндотоксинов. Слабо отрицательно или нейтрально заряженные белки чаще всего очищают с помощью анионообменной хроматографии [247]. В рН 8 большая часть таких белков будет‑десорбироваться при концентрации вытесняющего агента (например, хлорида натрия) 0,1-0,3 М.
Эндотоксины, будучи сильно связанными с матрицейсорбентов, десорбируются только при концентрации 0,5 М или выше. Однакотакие отрицательно заряженные белки, как бычий сывороточный альбумин,не будут эффективно очищаться от ЛПС [248].‑В случае основных, положительно заряженных белков используют катионообменную хроматографию. Теоретически, такие белки в рН 2-4 сорбируютсяматрицей, в то время как ЛПС элюируются без сорбции.Однако на практике ионообменная хроматография не всегда позволяет избавить многие белки от эндотоксинов до необходимых степеней чистоты, т.к.отрицательно заряженные ЛПС могут образовывать комплексы с белками.Например, как сообщалось Sang-Hyun Pyo и соавторами, при очистке рекомбинантного гистона Н 1.5, сильно основного белка (pI 10,91), на катионитеСП-сефарозе (GE Healthcare, Швеция) содержание эндотоксинов было снижено с 7,89 EU/мг до 7,48 EU/мг, а на анионите ДЭАЭ-сефарозе (GEHealthcare, Швеция) - до 7,33 EU/мг [249].‑Однако результаты ионообменной хроматографической очистки могут бытьзначительно улучшены, если использовать Тритон Х-114.
Раствор белкапредварительно смешивают с 1 % детергентом при пониженной температуре,а затем наносят на колонну, упакованную ионообменным сорбентом, предварительно уравновешенную подвижной фазой также включающей 1 % детергента. С повышением концентрации вытесняющей соли белок элюируется,практически лишенный эндотоксинных примесей (менее 0,05 EU/мг). Однакопроблема контроля чистоты очищенного продукта остается так же, как в случае использования двухфазной экстракции.
Также серьезным недостатком такого метода является использование очень больших объемов подвижных фаздля промывки колонны [250, 251].‑‑F74Адсорбционная хроматография. Было предложено использование хроматографии на активированном угле для удаления эндотоксинов [252, 253]. Одна‑‑ко такой метод можно применять для очистки подвижных фаз и растворов реагентов, используемых в биофармацевтических производствах, но не дляочистки белковых растворов из-за необратимой сорбции неселективными адсорбентами.Обращено-фазовая ВЭЖХ. Было неоднократно показано, что ОФ ВЭЖХ является отличным средством для избавления от эндотоксинов.
Гидрофобныелипидные группы обеспечивают эффективное связывание с неподвижной фазой ВЭЖХ-сорбентов, поэтому время удержания эндотоксинов значительновыше времени удержания большинства белков; более того, десорбция эндотоксинов наступает только при существенных концентрациях органическогомодификатора в подвижной фазе (до 70-90 % ацетонитрила) [254, 255].‑‑Действительно, многие рекомбинантные белки, очищенные с помощью ОФВЭЖХ, практически не содержат бактериальных эндотоксинов [256]. Среди‑таких продуктов – инсулин человека [257, 258], гормон роста [259], грануло‑‑‑цит-макрофаг колоний-стимулирующий фактор [260], β-интерферон [261] и‑‑другие.Однако со временем эндотоксины могут накапливаться на сорбенте, что приводит к их элюции вместе с продуктом, возможно, из-за вытеснения последним ЛПС с занятых ими активных центров сорбента [262].
Т.е. сорбент необ‑ходимо периодически депирогенизировать, промывая подвижной фазой,включающей помимо органического модификатора 1 М гидроксид натрияили 1-2 М уксусную кислоту. Подвижная фаза с крайними значениями рНможет негативно отразиться на работоспособности и сроке эксплуатациисорбента. Это, конечно, ограничивает использование ВЭЖХ для очистки белков от эндотоксинов.F75Хроматография гидрофобных взаимодействий. Хроматография гидрофобныхвзаимодействий, или HIC (hydrophobic interaction chromatography), являетсядостаточно популярным методом для очистки белков и пептидов, т.к.
замечательно вписывается в линейку «downstream» процесса: после ионообменнойхроматографии элюируемый продукт содержит значительное количествосоли, что позволяет наносить его сразу на HIC-колонну. Как и в случаеВЭЖХ, эндотоксины клеточной стенки удерживаются сорбентами HIC сильнее, чем белки. Однако HIC существенно уступает ВЭЖХ как в эффективности, так и в производительности. Основным достоинством перед ВЭЖХ является возможность проводить депирогенизацию сорбента растворами щелочей.Примеры использования такого метода хроматографической очистки от ЛПС:очистка на сорбенте фенил-тойоперл 650М (Tosoh, Япония) рекомбинантного42 кДа фрагмента белка MSP1, компонента противомалярийных вакцин[263]; очистка антигена вируса гепатита Б от пирогенов [264].‑‑Описана интересная оптимизация метода очистки белков от эндотоксинов спомощью хроматографии гидрофобных взаимодействий [247].
В раствор образца белка, предназначенного для нанесения на колонну, упакованную фенил-сефарозой (GE Healthcare, Швеция), вводили сульфат аммония и гуанидин-гидрохлорид в таких концентрациях, в которых не наблюдалось осаждения (высаливания) продукта (однако их концентрации должны быть близки кточке осаждения). В таких условиях продукт элюировался без сорбции, в товремя как эндотоксины связывались с лигандами сорбента. Таким способомудалось, выделяя целевой белок из телец включения, одновременно снизитьсодержание эндотоксинов с 1 100 000 EU/мг до 200 EU/мг.Аффинная хроматография.
На данный момент аффинная хроматография (АХ)является наиболее признанным методом избавления от эндотоксинов. ОднакоЛПС, биосинтезируемые различными штаммами, сильно отличаются друг отдруга главным образом из-за различных О-специфических цепей. Поэтомуаффинный сорбент, предназначенный для связывания ЛПС, должен специфи-F76чески взаимодействовать с наиболее консервативной частью эндотоксинов, аименно с липидом А. Такая специфичность может достигаться за счет модификации матрицы сорбента следующими лигандами: полимиксином Б, гистамином/гистидином, остатком деоксихолиевой кислоты, полиэтиленимином, поли-ε-лизином и т.д.Наибольшее распространение среди аффинных лигандов получил полимиксин Б (Рисунок 15). Он представляет собой поверхностно-активный положительно-заряженный циклический пептид, который способен дезагрегироватькомплексы с эндотоксинами и связываться с липидом А [265].
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
