Разработка научных основ создания технологии выделения и очистки генно-инженерных белков (1090305), страница 12
Текст из файла (страница 12)
Выделение и очистка генно-инженерных белковОчевидно, что весь цикл «downstream» процесса можно разделить на совокупность операций по выделению белка в той или иной форме из культуральной жидкости / клеток и очистки его от примесей. Для того чтобы определиться с операциями «downstream» процесса, нужно точно знать [218]:‑(1). Физико-химические свойства белка (аминокислотную последовательность, которая определяет заряд, массу, гидрофобность и т.д.; третичную последовательность – в основном, знание о цистеиновых связях и свободныхцистеинах; наличие или отсутствие посттрансляционных модификаций и т.д.,и т.п.);(2). Способ биопроцессинга белка (платформа биосинтеза, способ производства – интрацеллюлярно или экстрацеллюлярно, физическое состояние вклетке – в растворе или в тельцах включения);(3).
Спектр возможных примесей, включая возможности деградации продуктаво время производственных процессов и хранения.В широком плане можно представить себе «downstream» процесс следующейсхемой (Рисунок 12).F66FРисунок 12. Схема "downstream" процесса получения генно-инженерных белков.К интрацеллюлярным белкам можно относить в основном некоторые прокариотические белки (реже – дрожжевые белки). Стадии разрушения и отделения дебрисов являются в технологическом плане лимитирующими выделение– это основной недостаток интрацеллюлярных платформ биосинтеза.
Экстрацеллюлярные платформы, к которым относятся все эукариотические системы биосинтеза, лишены этого недостатка, что должно облегчать последующую очистку.Однако сам факт проведения дополнительных операций – а это не толькоописанные процедуры выделения белка из клеток, но еще и стадии отмывкител включения, их растворения в денатурирующих буферах – зачастую способствует тому, что белок, приходящий на очистку, гораздо более «чистый»по сравнению с подобным же экстрацеллюлярным белком.
Кроме того, кон-F67центрации выделяемых интрацеллюлярных белков также существенно выше,что облегчает и очистку, и внутрипроизводственный контроль всех этапов.Повторим, какие примеси должны быть минимизированы в ходе«downstream» процесса:(1). Процессуальные, а именно:(1.1).
Производные клеточного субстрата: остаточные нецелевые белки продуцента, балластные молекулы ДНК или ее фрагменты, компоненты клеточных стенок.(1.2). Производные клеточных культур: индукторы, антибиотики, плазма,компоненты питательных сред.(1.3). Производные «downstream» процесса: ферменты, химические и биохимические реагенты, неорганические соли, растворители, носители, смытые схроматографических колонн лиганды.(2). Родственные, а именно:(2.1).
Продукты ферментативной или химической деградации.(2.2). Модифицированные формы целевой молекулы: дезамидированные,изомеризованные, окисленные формы, формы с некорректно замкнутыми дисульфидными связями, формы с некорректными конъюгированными остатками (гликозилирование, фосфорилирование).(2.3). Агрегаты целевого белка.Очевидно, что максимальное избавление от примесей возможно только с помощью многостадийной очистки. В целом, многостадийность можно описатьтремя составляющими:- предочистка, или грубая очистка от механических включения и примесейтипов (1.1), (1.2), (2.3);- основная очистка, или избавление от родственных примесей типов (2.1),(2.2) и остатков (2.3);- финишная очистка, или доочистка от примесей типа (1.3) и, иногда, следовых количеств остальных примесей.F68К наиболее опасным для человека примесям, очистка от которых должнабыть максимально эффективна, относятся остатки нуклеиновых кислот продуцента, вирусы и эндотоксины клеточной стенки бактерий.4.1.
Очистка белков от бактериальных эндотоксиновЛипополисахариды (ЛПС), или бактериальные эндотоксины – это фрагментывнешней клеточной стенки всех грамотрицательных бактерий, высоко токсичные для человека и способные приводить к развитию ряда тяжелых заболеваний, даже таких как сепсис, рак и диабет [219, 220, 221]. Показано, что‑‑‑эндотоксины даже в очень низких концентрациях существенно воздействуютна организм животных и человека. Это воздействие главным образом определяется проведением токсического сигнала эндотоксина при участии TLR4,который является обязательным условием сигнализации эндотоксина, его активация запускает сложную систему взаимодействия сигнальных молекул,что приводит к проявлению токсических эффектов эндотоксина [222].
На‑пример, ингаляционное введение мышам 1 мкг ЛПС Escherichia coli O111:B4приводило к значительному возрастанию антител в крови животных (более3000 нг/мл IgE, более 2000 мкг/мл IgG) [223].‑Поэтому АФС, особенно служащие для создания инъекционных лекарственных форм, должны быть максимально избавлены от подобных примесей.Фармакопеи всего мира рекомендуют лимитировать содержание БЭ в лекарственных формах внутривенного назначения до 5 единиц (EU, или endotoxinunit) на кг веса тела за час [224].
Одна единица приблизительно равна 100 пкг‑эндотоксина.Ниже (Рисунок 13) приводится схематический вид химической структурыбактериального ЛПС [225]. Полисахаридный фрагмент содержит О-специфи‑ческую цепь, включающую повторяющуюся последовательность олигосахаридных единиц на основе гликозильных остатков (до 50), а также ядро [226].‑О-специфическая цепь уникальна для каждого прокариотического штамма;она вносит существенный вклад в серологическую специфичность, вызываяF69иммунный ответ в организмах человека и животных. Основными составляющими ядра являются остатки гептозы (гексапиранозы во внешней части ядраи L-глицеро-D-манногептозы во внутренней части), а также группы 2-кето-3деоксиоктоновой кислоты.Полисахаридная составляющаяЛипидная составляющаяCO2KdoPHepPPCO2KdoGlcNCO2HepHepKdoGlcNnFPPO-специфическая цепьВнешнее ядроВнутреннее ядроЛипид АВысоко вариабельный участокУмеренно вариабельный участокНизко вариабельный участокПочти не вариабельный участокРисунок 13.
Схематическая химическая структура бактериального липополисахарида. Сокращения:Hep - гептоза; Kdo - 2-кето-3-деоксиоктоновая кислота; GlcN - N-ацетилглюкозамин; P - фосфат.Липидный фрагмент эндотоксинов, или липид А, является наименее вариабельной и наиболее консервативной частью. Липид А отвечает за эндотоксическую активность [227]. Она проявляется в стимулировании производства и‑высвобождения гранулоцитами и макрофагами эндогенных медиаторов, таких как биоактивные липиды, NO, цитокины (например, интерлейкин-1 [228,‑229, 230]. Большие концентрации таких медиаторов в организме могут при‑‑вести к множеству различных патофизиологических реакций, как-то: повышение температуры тела, лейкопения, тахикардия, гипотония, рассеяннаявнутрисосудистая коагуляция и т.д. [231, 232].‑‑Важно отметить, что липид А и внутреннее ядро полисахаридной составляющей эндотоксинов частично фосфорилированы.
Это приводит к тому, что врастворах с нейтральным или основным рН эндотоксины будут иметь выраженный отрицательный заряд (рКа 1,3) [233].‑Молекулярная масса мономеров различных ЛПС может варьировать в достаточно широких диапазонах, что объясняется вариабельностью О-специфической цепи. Известны эндотоксины с молекулярными массами от 2,5 кДа (сукороченной О-специфической цепью) до 70 кДа (с очень длинной О-специ-F70фической цепью) [234]. Большая же часть ЛПС имеет молекулярную массу от‑10 до 20 кДа.Однако необходимо отметить, что мономерные ЛПС могут образовывать супрамолекулярные структуры за счет неполярных взаимодействий между липидными «хвостами», а также за счет образования «сшивок» фосфатныхгрупп бивалентными катионами [235, 236, 237].
Таким образом в водных рас‑‑‑творах эндотоксины могут агрегировать в ламелярные, кубические или инвертированные гексагональные структуры, такие как мицеллы или везикулы(Рисунок 14). Диаметр подобных структур достигает 0,1 мкм, а молекулярнаямасса - 1000 кДа. Бивалентные катионы, такие как Ca2+ и Mg2+, способствуютобразованию супрамолекулярных структур, а детергенты, ЭДТА и белки, наоборот, смещают равновесие в сторону образования мономерных форм [238,‑239].‑FРисунок 14. Схема полиморфизма липополисахаридов в водных растворах.Итак, ЛПС по своей природе гидрофобны (из-за включения липидных хвостов) и отрицательно-заряжены (из-за наличия остатков фосфорной кислоты).Несмотря на то, что мономеры ЛПС относительно малы (10-20 кДа), они могут образовывать высокомолекулярные (выше 1000 кДа) структуры, достаточно устойчивые в водных растворах.
Все эти свойства позволяют предлагать ряд решений для очистки белков, составляющих АФС, от примесныхбактериальных эндотоксинов.F711. Ультрафильтрация и гель-фильтрация. Очевидно, что супрамолекулярныеформы эндотоксинов (мицеллы и везикулы) могут быть достаточно легко отделены от белка с меньшей молекулярной массой.
Логично предположить,что такие методы как ультрафильтрация или гель-фильтрация могут быть использованы для очистки АФС.Показано, что использование ультрафильтрационных мембран с порами300 кДа позволяет достаточно эффективно (до концентрации 0,06 EU/мл)удалять ЛПС из водных растворов, не содержащих белков [240]. Однако‑большинство белков дестабилизируют супрамолекулярные структуры ЛПС,дезагрегируя их до мономерных форм. Поэтому для эффективного разделения необходимо дополнительно стимулировать полиморфизм эндотоксинов.Для этой цели предложено дополнительно вводить в раствор ионы бивалентных металлов, а именно Ca2+ или Mg2+ [241]. Эти ионы резко смещают равновесие в сторону образования везикул, размер которых более 1000 кДа, идаже после удаления катионов из раствора (в отсутствии дестабилизирующихфакторов) везикулы могут превращаться в мицеллы размером 300-1000 кДа,не распадаясь до мономеров.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
