Разработка научных основ создания технологии выделения и очистки генно-инженерных белков (1090305), страница 26
Текст из файла (страница 26)
Продукты ферментативного гидролиза анализировали методом ВЭЖХ (параметры анализа представлены в экспериментальной части).Полученные результаты представлены ниже (Рисунок 63в,г и Таблица 21).Время удержания пиков в стандартном образце и контрольном отличается втретьем знаке, что дает возможность говорить о соответствии между данными образцами и их идентичности.F166FРисунок 63. Методы подтверждения эквивалентности полученного инсулина-гларгина препарату"Лантус".
Масс-спектрометрия (а - препарат "Лантус"; б - полученный после ВЭЖХ ИГ, фракция 1).Пептидное картирование (в - препарата "Лантус"; г - получаемой АФС ИГ).F167Таблица 21. Результаты анализа пептидного картирования.Образец№ пикаВремя удержанияПик 120,386аПик 227,880Пик 337,682Пик 439,059Пик 120,401бПик 227,920Пик 337,691Пик 439,076По полученным результатам можно сказать, что физико-химическая (структурная) эквивалентность полученного генно-инженерного аналога инсулинапролонгированного действия оригинальному препарату «Лантус» подтверждена.F1683. Создание промышленной технологии выделения и очисткиN,N-бисметионилгистона Н1.3 в производстве оригинальногопрепарата «Онкохист».Актуальной задачей современной медицины является поиск и производстволекарственных средств для лечения онкологических заболеваний, в особенности лимфом.Лимфома - это онкологическое заболевание лимфатической ткани, характеризующееся увеличением лимфатических узлов и поражением различных внутренних органов, в которых происходит бесконтрольное накопление "опухолевых" лимфоцитов.Терапевтическое лечение злокачественных опухолей лимфоидного происхождения, рецидивирующих и часто устойчивых к химиотерапии, осуществляется за счёт импортных коммерческих препаратов, основанных на моноклональных антителах (МАТ), мишенью которых в организме человека, страдающего лимфомой, являются специфические поверхностные детерминанты.Наиболее распространенной детерминантой (примерно 95 %) оказаласьCD20, представляющая собой негликозилированный фосфорилированныйбелок, состоящий из 297 аминокислотных остатков (молекулярная масса32-37 кДа) [334].
CD 20 представлен на поверхности как незрелых, так и зре‑лых В-клеток.Однако в некоторых случаях препараты ритуксимаба не вызывают должноготерапевтического эффекта, причины чего изучены плохо [335]. Кроме того,‑терапия ритуксимабом может приводить к образованию в организме больногоантиидиотипических антител, приводящих к аутоиммунному ответу [336].‑Известно, что аналоги ритуксимаба на основе линкерных или ядерных гистонов или их производных лишены подобных недостатков, поэтому в противораковой терапии предложено использовать рекомбинантные гистоны и ихпроизводные.
Например, препараты на основе гистона класса Н1.3 представляют определенный интерес для лечения острого миелоидного лейкоза иНХЛ [337].‑F169Гистоны класса Н1 и их производные являются сравнительно небольшимибиомолекулами, проявляющими антираковый эффект внеклеточно и селективно связывающимися с бислоем фосфолипидов на поверхности мембранлимфоидных клеток.Организованная в 2001 году немецкая компания SymbioTec Gmbh поставиласвоей целью разработку экспрессионных систем для биосинтеза гистоновН1.3 и их производных в качестве аналогов ритуксимаба, а также разработкунеобходимых процессуальных этапов для получения активной фармацевтической субстанции [338].‑В частности, препараты на основе гистона класса Н1.3 представляют определенный интерес для лечения острого миелоидного лейкоза и НХЛ [339].‑Сотрудники компании SymbioTec определили следующее действие гистонана раковые клетки.
В здоровых клетках отрицательно заряженные фосфолипиды, такие как фосфотидилсерин, создают специфическую защиту на верхнем слое мембраны клетки. В раковых же клетках фосфотидилсерин теряеттакую способность вследствие его неправильного расположения в мембране.Такой изменённый фосфотидилсерин является специфичным рецептором длягистона Н1, формируя вместе с ним суперагрегаты, который приводят кбольшим перегруппировкам в мембране, формированию пор и в конечномсчёте к гибели клетки (Рисунок 64).F170FРисунок 64. Терапевтическое действие гистона на клетки лимфомы. Оранжевым цветом выделеныфосфатидилсерины.В настоящее время компания разработала и запатентовала один препарат длятерапии НХЛ. Этот препарат в 2003-2004 г успешно прошел первую фазуклинических испытаний в Европе, и в 2007 г FDA присвоила ему статус“Orphan Drug”.К “Orphan Drug” относятся фармацевтические средства, разработанные длялечения редких заболеваний, которые условно называются «сиротскими» болезнями.
Назначение данного статуса заболеванию и любым лекарственнымпрепаратам, разработанным для его лечения, является политическим вопросом во многих странах, и приводит к прорывам в медицине, которые не моглибы быть достигнуты иначе из-за экономики исследования и разработки лекарственных средств.
Выпуск “Orphan Drug” экономически не выгоден дляF171коммерческих предприятий из-за отсутствия постоянного рынка сбыта, поэтому разработку таких препаратов полностью оплачивает государство.Ядерный гистон Н1.3 представляет собой белок с молекулярной массой около22,5 кДа (221 а.о.). Как видно из представленной аминокислотной последовательности (Рисунок 65), он очень богат остатками лизина (61 а.о.), которыепридают ему выраженный положительный заряд (pI 11,02) [340].
N,N-бисме‑тионилгистон (БМГ) – это коммерческое название действующего вещества(препарат «Онкохист»), являющегося производным ядерного гистона Н1.3 иотличного от последнего тем, что на N-конце имеет дополнительный остатокметионина.FРисунок 65. Аминокислотная последовательность линкерного гистона Н1.3.Как видно из представленной третичной структуры, белок несет на себе зна-Fчительное количество гидрофобных доменов (Рисунок 66).F172Рисунок 66. Третичная структура гистона Н1.3 (Protein Databank). Синим цветом показаны гидрофобные домены белка.Указанные свойства могут быть использованы для разработки высокоэффективного процесса очистки БМГ.Первое, с чего мы вынуждены были начать при разработке технологии - создать и квалифицировать метод внутрипроизводственного контроля.
В случаеБМГ нам понадобилось иметь в арсенале три метода: уже существующий ихорошо известный метод Лэммли, а также два новых метода - ОФ ВЭЖХ иSEC.3.1. Валидация методов внутрипроизводственного контроля.Метод SEC, описанный выше в разделе 1.1 секции Результаты и обсуждение,должен быть применим и в случае анализа БМГ, т.к. молекулярная масса последнего вполне укладывается в калибровочный диапазон. ОФ ВЭЖХ, который мы взяли за основу, - это метод, используемый компанией Symbiotec, нослегка модифицированный [339].
В соответствии с требованиями GMP быливыбраны следующие критерии для оценки результатов проведенной валидации методов SEC и ОФ ВЭЖХ для контроля содержания и чистоты БМГ впрепаратах: линейность, воспроизводимость, сходимость, специфичность иустойчивость. Также был найден предел обнаружения методов. В качествеконтрольного образца использовался препарат Oncohist (предоставлен компанией Symbiotec).3.1.1. Линейность.Суть данного критерия заключается в том, что оцениваемый результат анализа (площадь пика) должен быть пропорционален концентрации аналита в образце. Как в случае ОФ ВЭЖХ, так и в случае SEC линейность оценивали вдиапазоне 0,5-1,5 мг/мл.F173В соответствии с нормативными требованиями, диапазон выбирали с запасомне менее 20% от планируемых значений.
Поэтому мы выбрали диапазон концентраций БМГ от 0,4 до 1,8 мг/мл.Для эксперимента были приготовлены 5 образцов с концентрациями аналита0,4; 0,7; 1,0; 1,4; 1,8 мг/мл. Каждый образец был проанализирован пять раз,площади хроматографических пиков определяли автоматически, полученныезначения использовали для построения регрессионной линии методом наименьших квадратов.При использовании ОФ ВЭЖХ для анализа содержания исследуемого белкабыло показано, что линейность сохраняется в диапазоне от 0,4 до 1,4 мг/мл, вэтом случае коэффициент детерминации R равен 0,9941 для общего числаизмерений n=25.Уравнение регрессионной линии имеет вид:Площадь пика =(15805±523,14)+(2366,9 454,64)×Концентрация (Ф6)При использовании ВЭЭХ линейность сохраняется в диапазоне от 0,4 до 1,8мг/мл; коэффициент линейной регрессии R равен 0,9859 при n=25.Уравнение регрессионной линии имеет вид:Площадь пика = (-0,06122±0,06)+(2,05591±0,05126)×Концентрация(Ф7)Показано, что результаты концентрации БМГ изменяются линейно внутриуказанного выше для обоих хроматографических методов диапазона.3.1.2.
Воспроизводимость и правильность.Воспроизводимость и правильность методики оценивали в течение двух днейна трех образцах с концентрациями 0,4; 1,0 и 1,8 мг/мл для SEC и 0,7; 1,0 и1,4 мг/мл для ОФ ВЭЖХ (каждый день готовили новые образцы). Анализ образцов каждой концентрации проводили по пять раз. Полученные результатыF174представлены ниже (Таблица 22). Как можно видеть из представленных результатов, значения коэффициентов вариации и относительных стандартныхотклонений не превышают установленного рекомендациями GMP предела в15%, следовательно, можно считать данные хроматографические методы контроля концентрации БМГ воспроизводимыми и точными.Таблица 22.
Результаты оценки устойчивости методики определения концентрации рекомбинантногоБМГ.SECНоминальнаяконцентрацияБМГ, мг/млТочность методаx±S, мг/млCV,%ОФ ВЭЖХПравильностьBias, %Точность методаx±S, мг/млПравильностьBias, %НоминальнаяконцентрацияБМГ, мг/млCV, %В течение первого одного дня, n=5 (аналитик 1)0,40,433±0,0276,258,250,646±0,0101,56-7,710,71,00,956±0,0313,23-4,440,912±0,0431,20-8,841,01,81,807±0,0844,670,391,486±0,0160,896,161,4В течение второго дня, n=5 (аналитик 2)0,40,420±0,0102,405,00,690±0,0486,94-1,430,71,01,005±0,0141,410,50,962±0,0616,35-3,811,01,81,831±0,0301,661,721,459±0,0342,344,181,4Здесь и в табл.
3: CV - коэффициент вариации; Bias - относительная систематическаяпогрешность.3.1.3. Пределы обнаружения и количественной оценки.Предел обнаружения методики составил 0,11 мг/мл для SEC и 0,01 мг/мл дляОФ ВЭЖХ. Нижний предел количественной оценки для SEC равен 0,35 мг/мл, а для ОФ ВЭЖХ - 0,04 мг/мл.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
