Разработка научных основ создания технологии выделения и очистки генно-инженерных белков (1090305), страница 33
Текст из файла (страница 33)
Оказалось, что существенное значение дляселективности процесса предочистки имеет то значение рН раствора, который, с одной стороны, используется для разбавления раствора белка послевирусной инактивации, и с другой, которым уравновешивается колонна. Былапроведена оптимизация значения рН этого буферного раствора (Рисунок 96).Для этого оценивали такие параметры процесса, как количество ФСГ, оказавшегося во фракции, не связавшейся с сорбентом (в «проскоке») по отношению к исходному количеству ФСГ в образце; содержание ФСГ в целевойF226фракции (чистота); выход процесса предочистки по ФСГ; десорбируемость,то есть количество общего белка, элюированного с колонны, отнесенное кисходному общему количеству белка в образце.
В результате установили, чтомаксимальная селективность процесса предочистки наблюдается прирН 6,9±0,05. При таких рН белок с одной стороны прекрасно связывается сактивными центрами сорбента, а с другой – элюируется с максимально высокими выходом и чистотой.FРисунок 96. Многопараметрическое влияние рН буферного раствора на селективность протеканияпредочистки ФСГ с помощью ДЭАЭ-сефарозы.Образец элюировали в такой же буферной системе (25 мМ трис, рН 6,9), ноповышая содержание хлорида натрия (Рисунок 97).
В результате целеваяфракция содержала около 30 % ФСГ от общего белка (SDS-PAGE), с концентрацией ФСГ 40±10 мг/мл (Рисунок 98).F227FРисунок 97. Хроматографическая очистка рекомбинантного ФСГ на ДЭАЭ-сефарозе (фракция 1 – целевой белок, фракция 2 – высокомолекулярные примеси). Голубая линия – УФ-детекция (mAu) процесса; зеленая – детекция изменения состава (%) подвижных фаз; коричневая – детекция измененияпроводимости (mS/См) подвижных фаз. Колонна Ø26 мм, объем 80 мл. Подвижная фаза: 25 мМ трис вводе для инъекций, рН 6,9, градиент хлорида натрия от 0 до 0,5 М.FРисунок 98. SDS-PAGE ФСГ в образце до предочистки анионообменной хроматографией (линия 2) и вцелевой фракции после очистки (линия 3). Линия 1 - стандарты молекулярных масс (LMW), слевауказаны значения масс в кДа.F2285.4.
Основная очистка ФСГ методами аффинной и гидрофобнойхроматографии.Полученный раствор белка разбавляли в 20 раз с целью снижения проводимости (концентрации соли) и подвергали основной очистке с помощью аффинной хроматографии. В качестве аффинного сорбента был выбран носитель, иммобилизованный синим красителем Cibacron F3GA, который представляет собой монохлорированный триазиновый пигмент, имеющий сродство ко многим гликозилированным белкам по причине своей структурнойсхожести с такими кофакторами, как НАД и НАДФ; кроме того, этот пигментобладает определенной гидрофобностью и в состоянии (но более слабо) взаимодействовать с гидрофобными доменами белков. По существу, это, конечно, псевдоаффинный сорбент, но его применимость оправдана в гораздобольшей степени, чем применимость таких истинно аффинных гелей, какProtein A-сефароза, иммобилизированная антителами IgG к ФСГ.
Как быловыяснено экспериментально, срок службы последнего - всего один циклочистки. Во время элюирования целевого ФСГ весь лиганд (антитела к ФСГ)гидролизуется с активных центров (белок А) сорбента, с одной стороны, приводя в негодность сам сорбент, а с другой - сильно загрязняя фракцию ФСГ.Образец белка наносили на предварительно уравновешенную колонну, упакованную тойоперлом AF-BlueHC-650M.
Большая часть примесных белковэлюировалась без связывания с сорбентом, в то время как некоторая часть их,наоборот, связывалась с сорбентом сильнее ФСГ из-за гидрофобных взаимодействий (Рисунок 99).F229FРисунок 99. Хроматографическая очистка рекомбинантного ФСГ на тойоперле AF-BlueHC-650M (целевая фракция отмечена штриховкой). Голубая линия – УФ-детекция (mAu) процесса; зеленая – детекция изменения состава (%) подвижных фаз; коричневая – детекция изменения проводимости (mS/См) подвижных фаз.
Колонна Ø26 мм, объем 200 мл. Подвижная фаза: 25 мМ трис в воде для инъекций, рН 6,9, градиент хлорида натрия от 0 до 0,5 М.В результате основной аффинной очистки удалось получить продукт с чистотой 74±8 % и выходом, близким к 100 %.Для очистки от следовых количеств аффинного лиганда, который неминуемосмывается с сорбента во время процесса, а также для доведения чистотыФСГ (включая отсутствие эндотоксинов) до параметров качества, требуемыхспецификацией, образец требовалось дочистить на высокоэффективной хроматографии.
Однако очищать продукт с помощью ОФ ВЭЖХ оказалось невозможно, потому что молекула ФСГ, как выяснилось, крайне нестабильна ворганических растворителях и распадается на две субъединицы без дальнейшей ренатурации. Поэтому нами был выбран бутил-тойоперл в качестве матрицы гидрофобных взаимодействий. Для этого в целевую фракцию, полученную в результате аффинной хроматографии, добавляли апирогенный хлориднатрия до его концентрации в растворе 3 М. Полученный солевой растворбелка наносили на предварительно уравновешенную колонну (Рисунок 100).F230FРисунок 100. Хроматографическая очистка рекомбинантного ФСГ на бутил-тойоперле (фракция 1 целевая). Голубая линия – УФ-детекция (mAu) процесса; зеленая – детекция изменения состава (%)подвижных фаз; коричневая – детекция изменения проводимости (mS/См) подвижных фаз.
КолоннаØ26 мм, объем 50 мл. Подвижная фаза: 25 мМ трис в воде для инъекций, рН 7,2, градиент хлорида натрия от 3 до 0 М.По данным внутрипроизводственного контроля (SDS-PAGE) чистота полученного после стадии основной доочистки ФСГ составила 96±1 %. Выход90±5 % (Рисунок 101).F231FРисунок 101. SDS-PAGE ФСГ в целевой фракции после аффинной хроматографии (линия 4) и в целевой фракции после хроматографии гидрофобных взаимодействий (линия 5). Линия 1 - стандарты молекулярных масс (LMW), слева указаны значения масс в кДа.5.5.
Финишная очистка и получение АФС.По данным внутрипроизводственного контроля (SDS-PAGE) чистота полученного после стадии основной доочистки ФСГ составила 96±1 %. Выход90±5 %.Финишную очистку проводили с помощью гель-фильтрации. Для этого наносили раствор белка на предварительно уравновешенную фосфатным буферомколонну, упакованную сефадексом G-75. Элюат собирали и замораживали,после чего лиофильно высушивали до получения сухой субстанции с влажностью не более 10 %.Разработанная технология выделения и очистки ФСГ позволила получитьАФС, удовлетворяющую требованиям спецификации (Таблица 32) с общимбиопроцессуальным выходом примерно 12 г / м3 культуральной жидкости.F232Таблица 32.
Результаты контроля качества готовой субстанции ФСГ.ПоказательМетодСпецификация(Норма)*Полученная АФСБактериальныеэндотоксины, ЕЭ/мкгЛАЛ-тестне более 1< 0,125Содержание ФСГ, %SDS-PAGEне менее 9596Активность, пкг/млИндукциянакопленияцАМФ в НЕК293клетках60-48080-120* Спецификация R&D Systems на рекомбинантный ФСГ человека [356].‑В общем виде технологическая схема процесса может быть представленаследующим образом. Биопроцесс проводят в промышленном биореакторе.При этом отделяют зрелые клетки от части культуральной жидкости, содержащей биосинтезированный ФСГ, с помощью внешнего перфузионногоустройства.
Затем полученную жидкость избавляют от возможной вируснойконтаминации с помощью хроматографической инактивации. Полученнуюинактивированную и обезвирусную фракцию предочищают с помощью анионообменной хроматографии в градиенте хлорида натрия. Чистые фракциисобирают, объединяют и разбавляют ВДИ в двадцать раз. После этого белокпоследовательно очищают на псевдоаффинном сорбенте и тойоперле с гидрофобной прививкой. Очищенный таким образом раствор перебуфериваютгель-фильтрацией, стерильно отфильтровывают, замораживают и лиофилизируют до сухого состояния. Схема процесса представлена ниже (Рисунок 102).F233Вода для инъекцийP-152P-125P-152P-125P-125P-125P-125P-125P-125P-125P-125P-148Емкость сначальнойпитательнойсредойP-153P-149P-160P-150P-356E-114P-189E-220P-167P-352ПерфузияE-113P-174Микрофильтрационныймодуль для перфузииЕмкость сраствором NaOHдля доведения рНP-358E-219P-210E-112P-358Емкость для жидкойАФСP-183E-100P-360Емкость дляперфузиатаP-188Емкость сосредой дляподпиткиЕмкость дляподвижной фазыP-355P-196Емкость суглекислотой длядоведения рНP-260V-48P-257P-175E-125E-214ХроматографическаясистемаP-273Стерильная фильтрацияE-215Емкость подфракцию ФСГE-150P-259E-122E-218P-272E-101E-168БиопроцессP-355E-169V-35Колонна ссефадексом G-75V-41P-354ЛиофилизацияЛиофильная машинаГель-фильтрацияP-197P-187E-103P-350E-221БиореакторP-157E-154P-199P-269Хроматографическая колоннас ДЭАЭсефарозойE-118P-165P-267P-268Инактивацияна анионитеV-40P-363P-276E-171E-154P-270Готовая АФС нахранениеE-109P-257P-259P-173E-222P-201E-117E-149Емкость дляфракцииинактивированного белкаE-146P-263E-129P-264P-204P-253E-165Основная очисткахроматографиейгидрофобныхвзаимодействийХроматографическая очисткааффинной хроматографиейP-349P-232P-316E-170E-197P-253ФракцииФСГФракции ФСГHIC-колоннаE-193Колонна санионитомE-147P-299E-154E-194P-322P-235P-310P-348E-190P-233E-152E-181P-255P-232P-316P-260P-303P-309P-305E-187P-318P-303Емкости дляготовыхподвижныхфазP-302E-191P-320E-189P-317E-188P-314P-258Емкости дляготовыхподвижныхфазХроматографическаясистемаE-196P-257E-150P-259ХроматографическаясистемаP-260P-275E-166P-274E-167P-273E-168P-272E-169V-41V-44P-269P-321P-307P-312P-315P-265P-306P-268P-267P-266V-45V-40P-313P-276E-192E-171P-270P-308P-303Емкости дляприготовленияподвижныхфазP-305P-309E-195P-319P-318E-186E-199P-311Емкости дляприготовленияподвижныхфазE-198P-304P-323P-260P-257P-258E-153P-261P-259E-149E-151P-262E-146P-263P-264Емкость дляутилизацииотходовFВода для инъекцийE-164P-230P-346P-230Рисунок 102.
Схема выделения и очистки ФСГ.P-261P-230P-230P-230F2345.6. Подтверждение эквивалентности.Так как ФСГ, технология получения которого нами разработана, являетсябиодженериком, то его эквивалентность может выяснена путем сравнения скоммерческим препаратом.Для подтверждения эквивалентности ФСГ, полученного в нашей лаборатории, были выбраны следующие методы:(1). SDS-PAGE;(2). Изоэлектрофокусирование.В обоих случаях сравнение проводили с коммерческим препаратом Гонал-Ф(Сероно С.А., Франция)5.6.1. SDS-PAGE.Сравнивали ФСГ нашего производства и Гонал-Ф с помощью SDS-PAGE напятикратной увеличенной нагрузке на дорожку (окрашивание серебром).Как видно из электрофореграммы (Рисунок 103), молекулярная масса (точнее, электрофоретическая подвижность в условиях SDS-PAGE) обоих препаратов идентична.F235FРисунок 103.
SDS-PAGE ФСГ нашего производства (линия 6) и в составе коммерческого препаратаГонал-Ф (линия 7). Линия 1 - стандарты молекулярных масс (LMW), слева указаны значения масс вкДа.5.6.2. Изоэлектрофокусирование.Определение изоэлектрической точки крайне важно для гликозилированныхбелков. Мы сравнивали pI нашего образца с pI коммерческого препарата Гонал-Ф. Как и ожидалось, оба препарата давали мультиплетные полосы в диапазоне рН от 3,5 до 5,5, что говорит об одинаковом профиле гликозилированности обоих белков (Рисунок 104).F236FРисунок 104. Изоэлектрофокусирование ФСГ нашего производства (линия 6) и в составе коммерческого препарата Гонал-Ф (линия 7).