Главная » Просмотр файлов » Разработка научных основ создания технологии выделения и очистки генно-инженерных белков

Разработка научных основ создания технологии выделения и очистки генно-инженерных белков (1090305), страница 33

Файл №1090305 Разработка научных основ создания технологии выделения и очистки генно-инженерных белков (Разработка научных основ создания технологии выделения и очистки генно-инженерных белков) 33 страницаРазработка научных основ создания технологии выделения и очистки генно-инженерных белков (1090305) страница 332018-01-18СтудИзба
Просмтор этого файла доступен только зарегистрированным пользователям. Но у нас супер быстрая регистрация: достаточно только электронной почты!

Текст из файла (страница 33)

Оказалось, что существенное значение дляселективности процесса предочистки имеет то значение рН раствора, который, с одной стороны, используется для разбавления раствора белка послевирусной инактивации, и с другой, которым уравновешивается колонна. Былапроведена оптимизация значения рН этого буферного раствора (Рисунок 96).Для этого оценивали такие параметры процесса, как количество ФСГ, оказавшегося во фракции, не связавшейся с сорбентом (в «проскоке») по отношению к исходному количеству ФСГ в образце; содержание ФСГ в целевойF226фракции (чистота); выход процесса предочистки по ФСГ; десорбируемость,то есть количество общего белка, элюированного с колонны, отнесенное кисходному общему количеству белка в образце.

В результате установили, чтомаксимальная селективность процесса предочистки наблюдается прирН 6,9±0,05. При таких рН белок с одной стороны прекрасно связывается сактивными центрами сорбента, а с другой – элюируется с максимально высокими выходом и чистотой.FРисунок 96. Многопараметрическое влияние рН буферного раствора на селективность протеканияпредочистки ФСГ с помощью ДЭАЭ-сефарозы.Образец элюировали в такой же буферной системе (25 мМ трис, рН 6,9), ноповышая содержание хлорида натрия (Рисунок 97).

В результате целеваяфракция содержала около 30 % ФСГ от общего белка (SDS-PAGE), с концентрацией ФСГ 40±10 мг/мл (Рисунок 98).F227FРисунок 97. Хроматографическая очистка рекомбинантного ФСГ на ДЭАЭ-сефарозе (фракция 1 – целевой белок, фракция 2 – высокомолекулярные примеси). Голубая линия – УФ-детекция (mAu) процесса; зеленая – детекция изменения состава (%) подвижных фаз; коричневая – детекция измененияпроводимости (mS/См) подвижных фаз. Колонна Ø26 мм, объем 80 мл. Подвижная фаза: 25 мМ трис вводе для инъекций, рН 6,9, градиент хлорида натрия от 0 до 0,5 М.FРисунок 98. SDS-PAGE ФСГ в образце до предочистки анионообменной хроматографией (линия 2) и вцелевой фракции после очистки (линия 3). Линия 1 - стандарты молекулярных масс (LMW), слевауказаны значения масс в кДа.F2285.4.

Основная очистка ФСГ методами аффинной и гидрофобнойхроматографии.Полученный раствор белка разбавляли в 20 раз с целью снижения проводимости (концентрации соли) и подвергали основной очистке с помощью аффинной хроматографии. В качестве аффинного сорбента был выбран носитель, иммобилизованный синим красителем Cibacron F3GA, который представляет собой монохлорированный триазиновый пигмент, имеющий сродство ко многим гликозилированным белкам по причине своей структурнойсхожести с такими кофакторами, как НАД и НАДФ; кроме того, этот пигментобладает определенной гидрофобностью и в состоянии (но более слабо) взаимодействовать с гидрофобными доменами белков. По существу, это, конечно, псевдоаффинный сорбент, но его применимость оправдана в гораздобольшей степени, чем применимость таких истинно аффинных гелей, какProtein A-сефароза, иммобилизированная антителами IgG к ФСГ.

Как быловыяснено экспериментально, срок службы последнего - всего один циклочистки. Во время элюирования целевого ФСГ весь лиганд (антитела к ФСГ)гидролизуется с активных центров (белок А) сорбента, с одной стороны, приводя в негодность сам сорбент, а с другой - сильно загрязняя фракцию ФСГ.Образец белка наносили на предварительно уравновешенную колонну, упакованную тойоперлом AF-BlueHC-650M.

Большая часть примесных белковэлюировалась без связывания с сорбентом, в то время как некоторая часть их,наоборот, связывалась с сорбентом сильнее ФСГ из-за гидрофобных взаимодействий (Рисунок 99).F229FРисунок 99. Хроматографическая очистка рекомбинантного ФСГ на тойоперле AF-BlueHC-650M (целевая фракция отмечена штриховкой). Голубая линия – УФ-детекция (mAu) процесса; зеленая – детекция изменения состава (%) подвижных фаз; коричневая – детекция изменения проводимости (mS/См) подвижных фаз.

Колонна Ø26 мм, объем 200 мл. Подвижная фаза: 25 мМ трис в воде для инъекций, рН 6,9, градиент хлорида натрия от 0 до 0,5 М.В результате основной аффинной очистки удалось получить продукт с чистотой 74±8 % и выходом, близким к 100 %.Для очистки от следовых количеств аффинного лиганда, который неминуемосмывается с сорбента во время процесса, а также для доведения чистотыФСГ (включая отсутствие эндотоксинов) до параметров качества, требуемыхспецификацией, образец требовалось дочистить на высокоэффективной хроматографии.

Однако очищать продукт с помощью ОФ ВЭЖХ оказалось невозможно, потому что молекула ФСГ, как выяснилось, крайне нестабильна ворганических растворителях и распадается на две субъединицы без дальнейшей ренатурации. Поэтому нами был выбран бутил-тойоперл в качестве матрицы гидрофобных взаимодействий. Для этого в целевую фракцию, полученную в результате аффинной хроматографии, добавляли апирогенный хлориднатрия до его концентрации в растворе 3 М. Полученный солевой растворбелка наносили на предварительно уравновешенную колонну (Рисунок 100).F230FРисунок 100. Хроматографическая очистка рекомбинантного ФСГ на бутил-тойоперле (фракция 1 целевая). Голубая линия – УФ-детекция (mAu) процесса; зеленая – детекция изменения состава (%)подвижных фаз; коричневая – детекция изменения проводимости (mS/См) подвижных фаз.

КолоннаØ26 мм, объем 50 мл. Подвижная фаза: 25 мМ трис в воде для инъекций, рН 7,2, градиент хлорида натрия от 3 до 0 М.По данным внутрипроизводственного контроля (SDS-PAGE) чистота полученного после стадии основной доочистки ФСГ составила 96±1 %. Выход90±5 % (Рисунок 101).F231FРисунок 101. SDS-PAGE ФСГ в целевой фракции после аффинной хроматографии (линия 4) и в целевой фракции после хроматографии гидрофобных взаимодействий (линия 5). Линия 1 - стандарты молекулярных масс (LMW), слева указаны значения масс в кДа.5.5.

Финишная очистка и получение АФС.По данным внутрипроизводственного контроля (SDS-PAGE) чистота полученного после стадии основной доочистки ФСГ составила 96±1 %. Выход90±5 %.Финишную очистку проводили с помощью гель-фильтрации. Для этого наносили раствор белка на предварительно уравновешенную фосфатным буферомколонну, упакованную сефадексом G-75. Элюат собирали и замораживали,после чего лиофильно высушивали до получения сухой субстанции с влажностью не более 10 %.Разработанная технология выделения и очистки ФСГ позволила получитьАФС, удовлетворяющую требованиям спецификации (Таблица 32) с общимбиопроцессуальным выходом примерно 12 г / м3 культуральной жидкости.F232Таблица 32.

Результаты контроля качества готовой субстанции ФСГ.ПоказательМетодСпецификация(Норма)*Полученная АФСБактериальныеэндотоксины, ЕЭ/мкгЛАЛ-тестне более 1< 0,125Содержание ФСГ, %SDS-PAGEне менее 9596Активность, пкг/млИндукциянакопленияцАМФ в НЕК293клетках60-48080-120* Спецификация R&D Systems на рекомбинантный ФСГ человека [356].‑В общем виде технологическая схема процесса может быть представленаследующим образом. Биопроцесс проводят в промышленном биореакторе.При этом отделяют зрелые клетки от части культуральной жидкости, содержащей биосинтезированный ФСГ, с помощью внешнего перфузионногоустройства.

Затем полученную жидкость избавляют от возможной вируснойконтаминации с помощью хроматографической инактивации. Полученнуюинактивированную и обезвирусную фракцию предочищают с помощью анионообменной хроматографии в градиенте хлорида натрия. Чистые фракциисобирают, объединяют и разбавляют ВДИ в двадцать раз. После этого белокпоследовательно очищают на псевдоаффинном сорбенте и тойоперле с гидрофобной прививкой. Очищенный таким образом раствор перебуфериваютгель-фильтрацией, стерильно отфильтровывают, замораживают и лиофилизируют до сухого состояния. Схема процесса представлена ниже (Рисунок 102).F233Вода для инъекцийP-152P-125P-152P-125P-125P-125P-125P-125P-125P-125P-125P-148Емкость сначальнойпитательнойсредойP-153P-149P-160P-150P-356E-114P-189E-220P-167P-352ПерфузияE-113P-174Микрофильтрационныймодуль для перфузииЕмкость сраствором NaOHдля доведения рНP-358E-219P-210E-112P-358Емкость для жидкойАФСP-183E-100P-360Емкость дляперфузиатаP-188Емкость сосредой дляподпиткиЕмкость дляподвижной фазыP-355P-196Емкость суглекислотой длядоведения рНP-260V-48P-257P-175E-125E-214ХроматографическаясистемаP-273Стерильная фильтрацияE-215Емкость подфракцию ФСГE-150P-259E-122E-218P-272E-101E-168БиопроцессP-355E-169V-35Колонна ссефадексом G-75V-41P-354ЛиофилизацияЛиофильная машинаГель-фильтрацияP-197P-187E-103P-350E-221БиореакторP-157E-154P-199P-269Хроматографическая колоннас ДЭАЭсефарозойE-118P-165P-267P-268Инактивацияна анионитеV-40P-363P-276E-171E-154P-270Готовая АФС нахранениеE-109P-257P-259P-173E-222P-201E-117E-149Емкость дляфракцииинактивированного белкаE-146P-263E-129P-264P-204P-253E-165Основная очисткахроматографиейгидрофобныхвзаимодействийХроматографическая очисткааффинной хроматографиейP-349P-232P-316E-170E-197P-253ФракцииФСГФракции ФСГHIC-колоннаE-193Колонна санионитомE-147P-299E-154E-194P-322P-235P-310P-348E-190P-233E-152E-181P-255P-232P-316P-260P-303P-309P-305E-187P-318P-303Емкости дляготовыхподвижныхфазP-302E-191P-320E-189P-317E-188P-314P-258Емкости дляготовыхподвижныхфазХроматографическаясистемаE-196P-257E-150P-259ХроматографическаясистемаP-260P-275E-166P-274E-167P-273E-168P-272E-169V-41V-44P-269P-321P-307P-312P-315P-265P-306P-268P-267P-266V-45V-40P-313P-276E-192E-171P-270P-308P-303Емкости дляприготовленияподвижныхфазP-305P-309E-195P-319P-318E-186E-199P-311Емкости дляприготовленияподвижныхфазE-198P-304P-323P-260P-257P-258E-153P-261P-259E-149E-151P-262E-146P-263P-264Емкость дляутилизацииотходовFВода для инъекцийE-164P-230P-346P-230Рисунок 102.

Схема выделения и очистки ФСГ.P-261P-230P-230P-230F2345.6. Подтверждение эквивалентности.Так как ФСГ, технология получения которого нами разработана, являетсябиодженериком, то его эквивалентность может выяснена путем сравнения скоммерческим препаратом.Для подтверждения эквивалентности ФСГ, полученного в нашей лаборатории, были выбраны следующие методы:(1). SDS-PAGE;(2). Изоэлектрофокусирование.В обоих случаях сравнение проводили с коммерческим препаратом Гонал-Ф(Сероно С.А., Франция)5.6.1. SDS-PAGE.Сравнивали ФСГ нашего производства и Гонал-Ф с помощью SDS-PAGE напятикратной увеличенной нагрузке на дорожку (окрашивание серебром).Как видно из электрофореграммы (Рисунок 103), молекулярная масса (точнее, электрофоретическая подвижность в условиях SDS-PAGE) обоих препаратов идентична.F235FРисунок 103.

SDS-PAGE ФСГ нашего производства (линия 6) и в составе коммерческого препаратаГонал-Ф (линия 7). Линия 1 - стандарты молекулярных масс (LMW), слева указаны значения масс вкДа.5.6.2. Изоэлектрофокусирование.Определение изоэлектрической точки крайне важно для гликозилированныхбелков. Мы сравнивали pI нашего образца с pI коммерческого препарата Гонал-Ф. Как и ожидалось, оба препарата давали мультиплетные полосы в диапазоне рН от 3,5 до 5,5, что говорит об одинаковом профиле гликозилированности обоих белков (Рисунок 104).F236FРисунок 104. Изоэлектрофокусирование ФСГ нашего производства (линия 6) и в составе коммерческого препарата Гонал-Ф (линия 7).

Характеристики

Список файлов диссертации

Свежие статьи
Популярно сейчас
Как Вы думаете, сколько людей до Вас делали точно такое же задание? 99% студентов выполняют точно такие же задания, как и их предшественники год назад. Найдите нужный учебный материал на СтудИзбе!
Ответы на популярные вопросы
Да! Наши авторы собирают и выкладывают те работы, которые сдаются в Вашем учебном заведении ежегодно и уже проверены преподавателями.
Да! У нас любой человек может выложить любую учебную работу и зарабатывать на её продажах! Но каждый учебный материал публикуется только после тщательной проверки администрацией.
Вернём деньги! А если быть более точными, то автору даётся немного времени на исправление, а если не исправит или выйдет время, то вернём деньги в полном объёме!
Да! На равне с готовыми студенческими работами у нас продаются услуги. Цены на услуги видны сразу, то есть Вам нужно только указать параметры и сразу можно оплачивать.
Отзывы студентов
Ставлю 10/10
Все нравится, очень удобный сайт, помогает в учебе. Кроме этого, можно заработать самому, выставляя готовые учебные материалы на продажу здесь. Рейтинги и отзывы на преподавателей очень помогают сориентироваться в начале нового семестра. Спасибо за такую функцию. Ставлю максимальную оценку.
Лучшая платформа для успешной сдачи сессии
Познакомился со СтудИзбой благодаря своему другу, очень нравится интерфейс, количество доступных файлов, цена, в общем, все прекрасно. Даже сам продаю какие-то свои работы.
Студизба ван лав ❤
Очень офигенный сайт для студентов. Много полезных учебных материалов. Пользуюсь студизбой с октября 2021 года. Серьёзных нареканий нет. Хотелось бы, что бы ввели подписочную модель и сделали материалы дешевле 300 рублей в рамках подписки бесплатными.
Отличный сайт
Лично меня всё устраивает - и покупка, и продажа; и цены, и возможность предпросмотра куска файла, и обилие бесплатных файлов (в подборках по авторам, читай, ВУЗам и факультетам). Есть определённые баги, но всё решаемо, да и администраторы реагируют в течение суток.
Маленький отзыв о большом помощнике!
Студизба спасает в те моменты, когда сроки горят, а работ накопилось достаточно. Довольно удобный сайт с простой навигацией и огромным количеством материалов.
Студ. Изба как крупнейший сборник работ для студентов
Тут дофига бывает всего полезного. Печально, что бывают предметы по которым даже одного бесплатного решения нет, но это скорее вопрос к студентам. В остальном всё здорово.
Спасательный островок
Если уже не успеваешь разобраться или застрял на каком-то задание поможет тебе быстро и недорого решить твою проблему.
Всё и так отлично
Всё очень удобно. Особенно круто, что есть система бонусов и можно выводить остатки денег. Очень много качественных бесплатных файлов.
Отзыв о системе "Студизба"
Отличная платформа для распространения работ, востребованных студентами. Хорошо налаженная и качественная работа сайта, огромная база заданий и аудитория.
Отличный помощник
Отличный сайт с кучей полезных файлов, позволяющий найти много методичек / учебников / отзывов о вузах и преподователях.
Отлично помогает студентам в любой момент для решения трудных и незамедлительных задач
Хотелось бы больше конкретной информации о преподавателях. А так в принципе хороший сайт, всегда им пользуюсь и ни разу не было желания прекратить. Хороший сайт для помощи студентам, удобный и приятный интерфейс. Из недостатков можно выделить только отсутствия небольшого количества файлов.
Спасибо за шикарный сайт
Великолепный сайт на котором студент за не большие деньги может найти помощь с дз, проектами курсовыми, лабораторными, а также узнать отзывы на преподавателей и бесплатно скачать пособия.
Популярные преподаватели
Добавляйте материалы
и зарабатывайте!
Продажи идут автоматически
6392
Авторов
на СтудИзбе
307
Средний доход
с одного платного файла
Обучение Подробнее