Разработка научных основ создания технологии выделения и очистки генно-инженерных белков (1090305), страница 34
Текст из файла (страница 34)
Линия 1 - стандарты изоэлектрических точек, слева указаны значения pI.Таким образом, можно говорить о практически полной эквивалентности ФСГ,полученного по разработанной нами технологии, и ФСГ в составе коммерческого препарата Гонал-Ф.6. Алгоритм разработки технологий выделения и очистки генно-инженерных белковСвойства генно-инженерных белков в биофармацевтике определенным образом влияют на выбор стратегий при разработке «downstream» и «upstream»процессов.
Нами на практике изучались такие объекты, как прокариотическисинтезируемые белки, один из которых биосинтезируется в составе предшественника, который образует тела включения в клетках (инсулин-гларгин),второй - образует тела включения, но биосинтезируется не в составе предшественника (интерферон-гамма), третий является цитоплазматическим белкоми не образует тел включения (N,N-бисметионилгистон); а также эукариотиче-F237ски производимый гликозилированный и субъединичный белок, биосинтезирующийся экстрацеллюлярно (фоликулостимулирующий гормон).Выбор стратегий разработки процессов выделения и очистки каждого из вышеперечисленных примеров можно продемонстрировать в виде блок-схемы(Рисунок 105). Стоит отметить, что представленный блок-схемой методологический алгоритм является в достаточной степени универсальным и пригодным для разработки технологии выделения и очистки любого генно-инженерного белка.Анализируя эту блок-схему, можно сделать несколько практических выводов:(1).
Процессы биосинтеза, выделения и очистки должны основываться на физико-химических свойствах генно-инженерного белка, должны проводиться вусловиях, исключающих денатурацию (исключение – целенаправленная денатурация белков в составе тел включения) и потерю активности, должныбыть совместимы с остальными производственными стадиями.(2). Этапы «downstream» процесса являются наиболее важными и многостадийными. Многостадийность обусловлена необходимостью получать продуктмаксимально высокого качества, параметры которого заданы спецификацией.(3).
Спецификация на продукт является базисом, на котором зиждется стратегия проведения как «upstream», так и «downstream» процесса. Что можно видеть на представленной ниже диаграмме (Рисунок 106).F238FРисунок 105. Блок-схема разработки стратегии выделения и очистки биофармацевтического белка,исходя из его свойств.F239FРисунок 106. Диаграмма проектирования требований к качеству биофармацевтической продукции,исходя из свойств объекта исследований.Эта диаграмма (Рисунок 106) демонстрирует, что свойства молекулы определяют начальные условия стратегии разработки технологии выделения иочистки: с чего начинать и какими методами пользоваться, - а требованияспецификации определяют то, к чему следует стремиться при разработке этойтехнологии, так сказать, граничные условия.
А способы «upstream» и«downstream» процессов рождаются на стыке условий начальных и граничных. И основываются на знании специфики биофармацевтических производств и здравом смысле.F240МАТЕРИАЛЫ, ПРИБОРЫ И МЕТОДЫ1. Материалы1.1. РеактивыВ работе использовали:5-диметиламин-нафтосульфохлорид (ICN polypharm, США);L-аргинин HCl (MP, США);ангидрид цитраконовый (Sigma-Aldrich, США);ацетон (Biosolve, Израиль);ацетонитрил (Biosolve, Израиль);гексадецилтриметиламмоний бромид (Merck, Германия);гидроксид аммония 24 % (Химмед, РФ);глутатион восстановленный (МР, США);глутатион окисленный (МР, США);гуанидин-гидрохлорид (Panreac, Испания);диметилсульфоксид (Biosolve, Израиль);диметилформамид (Biosolve, Израиль);дитиотреитол (Sigma-Aldrich, США);додецилсульфат натрия (MP, США);кислота азотная (Химмед, РФ);кислота лимонная (Merck, Германия);кислота лимонная (Panreac, Испания);кислота молочная (MP, США);кислота ортофосфорная (Химмед, РФ);кислота серная (Химмед, РФ);кислота соляная (Panreac, Испания);кислота трифторуксусная (Химмед, РФ);кислота трифторуксусная, (Sigma-Aldrich США);кислота уксусная (Химмед, РФ);метионин (Panreac, Испания);мочевина (Panreac, Испания);F241натрия гидроксид (Химмед, РФ);натрия сульфат (Sigma-Aldrich, США);натрия хлорид (Panreac, Испания);спирт изопропиловый (Химмед, РФ);спирт этиловый (Химмед, РФ);трипсин бычий панкреатический, активность 280 МЕ/мг (Sigma, США);трис(гидроксиметил)-аминометан, трис (ICN, США);триэтаноламин (Sigma-Aldrich, США);цетилтриметиламмоний бромид (Sigma-Aldrich, США);цинк уксуснокислый (MP, США);цистеамин (МР, США);цистеин-L (MP, США);цистин (МР, США);Все использованные реактивы квалификации «хч», «осч» либо фармакопейной чистоты.1.2.
Хроматографические сорбенты и колонныВ работе использовали следующие сорбенты:Kromasil C4-16 мкм-30 нм (Eka Chemicals, Швеция);Kromasil C8-16 мкм-11нм (Eka Chemicals, Швеция);AF-BlueHC-650M, 75 мкм (Tosoh, Япония);Butyl-600M-toyoperl, 75 мкм (Tosoh, Япония);Hexyl-650C-toyoperl, 150 мкм (Tosoh, Япония);YMC Basic C8-15 мкм-20 нм (YMC Co, Германия);YMC Butyl C4-15 мкм-30 нм (YMC Co, Германия);YMC ODS-A C18-15 мкм-20 нм (YMC Co, Германия);CHP55A, 4 мкм (Mitsubishi, Япония);BioPro S-75 (YMC Co, Германия);Macroprep High S (Bio-Rad, США);F242ДЭАЭ-сефароза (GE Healthcare, Швеция);Сефадекс G-50-SF (GE Healthcare, Швеция);Сефадекс G-75-M (GE Healthcare, Швеция);Sephacryl S-100 (GE Healthcare, Швеция);Перечисленные сорбенты упаковывались в следующие хроматографиическиеколонны:BPG450, размер 800х450 мм I.D.
(GE Heathcare, Швеция);Kronlab, размер 125х10 мм I.D. (YMC Co, Германия);Kronlab, размер 250х25 мм I.D. (YMC Co, Германия);Kronlab, размер 250х50 мм I.D. (YMC Co, Германия);YMC-DAU150-700, размер 700х150 мм I.D. (YMC Co, Германия);YMC-DAU100-700, размер 700х100 мм I.D. (YMC Co, Германия);стальные колонны, размер 250х4,6 мм I.D. (н/д о производителе).В работе использовали следующие аналитические колонки:Luna C18-2, C18-5 мкм-10 нм, размер 250х4,6 мм I.D.
(Phenomenex, США);YMC-Pack ODS-A, C18-3 мкм-20 нм, размер 125х2,1 мм I.D. (YMC Co, Германия);YMC-Pack ODS-A, C18-5 мкм-20 нм, размер 250х4,6 мм I.D. (YMC Co, Германия);YMC-Diol, 5 мкм-12 нм, размер 300х8 мм I.D. (YMC Co, Германия);YMC-Triart, C18-3 мкм-12 нм, размер 50х2,1 мм I.D. (YMC Co, Германия);YMC-Hydrosphere, C18-2 мкм-12 нм, размер 50х2,1 мм I.D. (YMC Co, Германия);Также в работе использовали следующие мембранные адсорберы производства Sartotius Stedim (Германия):Sartobind mini S;Sartobind mini Q;Sartobind nano S;F243Sartobind nano Q.2. Приборы2.1.
Хроматографические системыВ работе использовали:система для ВЭЖХ Agilent 1100, снабженная двухплунжерным насосом производительностью до 10 мл/мин, термостатом колонок, инжектором с дозирующей петлей 20 мкл, УФ-детектором с вариабельной длиной волны от 190до 300 нм и компьютером с программным комплексом обработки данных иуправления прибором HP Chem (Agilent Technologies, США);система для ВЭЖХ Agilent 1200, снабженная двухплунжерным насосом производительностью до 10 мл/мин, термостатом колонок, инжектором с дозирующей петлей 20 мкл, УФ-детектором с вариабельной длиной волны от 190до 300 нм и компьютером с программным комплексом обработки данных иуправления прибором HP Chem (Agilent Technologies, США);система для ВЭЖХ, снабженная двухплунжерным насосом System Gold производительностью до 10 мл/мин (Beckman, США), инжектором с дозирующими петлями от 2 до 2000 мкл (Rheodyne, Швеция), УФ-детекторомLambda-Max с вариабельной длиной волны от 190 до 300 нм (Waters, США) икомпьютером с программным комплексом обработки данных и управленияприбором System Gold (Beckman, США);система для ВЭЖХ, снабженная изократическим насосом Applied Biosystemsпроизводительностью до 9,9 мл/мин (Applied Biosystems, США), инжекторомс дозирующей петлей 10 мкл (Rheodyne, Швеция), УФ-детектором AppliedBiosystems с вариабельной длиной волны от 190 до 300 нм (AppliedBiosystems, США) и компьютером с программным комплексом обработкиданных МультиХром (Ampersand, РФ);система для ЖХ Akta Basic 100, снабженная четырехплунжерным насосомпроизводительностью до 100 мл/мин, инжектором с дозирующими петлямиот 500 до 2000 мл, проточным кондуктометром, проточным рН-метром, УФ-F244детектором с тремя вариабельными длинами волн от 190 до 300 нм и компьютером с программным комплексом обработки данных и управления прибором Unicorn (GE Healthcare, Швеция);система для препаративной ВЭЖХ Knauer, снабженная изократическим насосом производительностью до 250 мл/мин, градиентным задатчиком на линиивсасывания, УФ-детектором с вариабельной длиной волны от 190 до 300 нм(Knauer, Германия);система для препаративной ВЭЖХ YMC, снабженная трехплунжерным насосом производительностью 500 мл/мин (Armen, Франция), УФ-детектором снабором длин волн 200, 220, 254, 280 нм (Knauer, Германия), коллекторомфракций HSW (Kronlab, YMC Co, Германия) и компьютером с программнымкомплексом обработки данных и управления прибором PrepCon (SCPA, Германия).2.2.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
