Диссертация (Молекулярно-генетические основы ювенильного артрита), страница 9

Дляэтого готовилась смесь объемом 10 мкл (состав: 5 мкл амплификата, 5 единицактивности фермента, 1 мкл специфического буфера и деионизированная вода до10 мкл), которая затем выдерживалась при температуре 37°С в течение ночи.Для интерпретации результатов продукты ПЦР (в том числе после ихгидролитического расщепления) сначала разделялись путем вертикальногоэлектрофорезаиспользованиемвнеденатурирующемоднократного7%-номтрисборатногополиакриламидномбуфера.гелесПредварительноамплификат смешивался в соотношении 1:5 с буфером, содержащим 0,25%бромфенолового синего, 0,25% ксиленцианола, 15% фикола, и далее наносился на48гель,приготовленныйспомощьюстеклянныхпластин.Поокончанииэлектрофореза гель помещался на 10 минут в окрашивающий раствор (0,1 мкг/млбромистого этидия), а затем просматривался в ультрафиолетовых лучах натрансиллюминаторе («Vilber Lourmat», TCP-20M).

Определение длин фрагментовпроводилось с использованием ДНК-маркера фирмы «Сибэнзим».Проведение ПЦР c регистрацией результатов в режиме реального времениПЦР c регистрацией результатов в режиме реального времени (ПЦР-РВ)проводилась на приборе «StepOnePlus» («Applied Biosystems», США).В состав стандартной реакционной смеси для ПЦР-РВ объемом 25 мклвходили следующие компоненты: 2,5 мкл реакционного буфера (стандартный 10XTaq буфер (с содержанием ионов магния в концентрации 30 мМ), производствоЗАО «Евроген», Россия); 0,5 мкл 10 мМ смеси дезоксинуклеозидтрифосфатов (ЗАО«Евроген», Россия); 2,5 мкл смеси специфических олигонуклеотидных праймеров(F+R) с концентрацией 10 мкМ; по 1,0 мкл специфических флуоресцентно-меченыхзондов (TaqMan) c концентрацией 10 мкМ; 1,0 мкл геномной ДНК с концентрацией100 нг/мкл; 0,5 мкл HS Taq ДНК-полимеразы с концентрацией 5 единиц на мкл(ЗАО «Евроген», Россия); деионизированная вода до 25 мкл.Специфические олигонуклеотидные праймеры и флуоресцентно-меченыезонды (TaqMan) были разработаны и синтезированы ООО «ДНК-Синтез» (Россия).ПрограммадляпроведенияПЦР-РВвключаласледующиеэтапы:предварительная денатурация (95oC, 3 мин) и 40 циклов амплификации(денатурация (95oC, 20 сек), отжиг праймеров (55oC, 30 сек (57oC, 1 мин дляrs755622 гена MIF)) (измерение флуоресценции), синтез (72oC, 40 сек)).РегистрацияавтоматическомрезультатовПЦРрежимеиспользованиемсиихинтерпретацияпроводиласьпрограммногоStepOne Software v2.2.2 («Applied Biosystems», США).вобеспечения49Исследование уровня цитокинов TNFα, IL1β, IL6, IL10 в сыворотке крови, ихспонтанной и митоген-индуцированной продукции в культуре клеток цельнойкрови пациентов с ЮИА перед назначением метотрексатаЗабор материала у пациентов с ЮИА проводился утром натощак перединициацией терапии метотрексатом.Для получения сыворотки периферическая венозная кровь в объеме 2-3 млотбиралась в вакуумные пробирки с активатором свертывания, затем через 40-50мин центрифугировалась при 3000 об/мин в течении 15 мин.

Аликвоты сывороткиобъемом 300 мкл хранились при -80°С до 1 года.Для исследования спонтанной и митоген-индуцированной продукциицитокинов в культуре клеток цельной крови использовались наборы «ЦИТОКИНСТИМУЛ-БЕСТ»(АО«Вектор-Бест»,Россия).Согласнорекомендациямпроизводителя, культивирование проводилось в термостате при 37°С в течение 24часов. В качестве питательной среды использовалась среда ДМЕМ: для оценкиспонтанной продукции цитокинов – без митогена, для оценки митогениндуцированнойпродукции(фитогемагглютинин,цитокиновконканавалинА–сикомплексныммитогеномлипополисахарид).Послецентрифугирования при 3000 G в течение 10 мин надосадочная жидкостьотбиралась по 300 мкл и хранилась при -80°С не более 1 года.Исследование содержания TNFα, IL1β, IL6, IL10 в сыворотке крови, а такжеуровня их спонтанной и митоген-индуцированной продукции в культуре клетокцельной крови проводилось методом твердофазного иммуноферментного анализа(наборы ООО «Цитокин», анализатор «Stat Fax 2100» («Awareness Technology,Inc»)).Перед проведением анализа проводилось разведение образцов: дляисследования митоген-индуцированной продукции – в 2 раза (IL10), в 4 раза (TNFα,IL1β), в 20 раз (IL6); при исследовании спонтанной продукции и сывороточногоуровня – выборочно (в случае превышения максимальной оптической плотности,регистрируемой прибором, анализ повторялся с разведением в 2-10 раз).502.3 Статистические методы обработки результатов исследованияМатематическуюобработкурезультатовисследованияпроводилисиспользованием программ Microsoft Excel, SNPStats, R v.3.4.2, PowerMarker v.3.25,STATISTICA v.10 (StatSoft, Inc.), MDR v.3.0.2 [177, 193, 238, 259].Приописаниикачественныхпризнаковуказывалиабсолютныеиотносительные показатели (частоты) [14].Проверка соответствия наблюдаемых частот генотипов полиморфныхлокусов у больных с ЮИА и в контрольной группе ожидаемому согласноуравнению Харди-Вайнберга проводилась в программе SNPStats [259].Для сравнения качественных данных (частот генотипов, аллелей, сочетанийгенотипов) в исследуемых группах применялся точный двусторонний критерийФишера [150, 188, 189].Для оценки наличия и степени влияния различных факторов на риск развитиятого или иного состояния рассчитывался показатель отношения шансов (odds ratio,OR), при этом использовалась формула: OR = (a x d) / (b x с), – где a и c – числоиндивидов с наличием и отсутствием признака в группе, где исследуемоесостояние наблюдается; b и d – число индивидов с наличием и отсутствиемпризнака в группе, где исследуемое состояние не наблюдается [111, 266].Для оценки точности полученного значения OR рассчитывался точныйусловный 95%-й доверительный интервал (95% CI) Baptista-Pike (в программе Rv.3.4.2 с пакетом «ORCI») [111].Сравнение частот гаплотипов и определение предполагаемых моделейнаследования по отдельным локусам (кодоминантная, доминантная, рецессивная,сверхдоминантнаяилог-аддитивная)проводилосьпутемприменениялогистической регрессии в программе SNPSTats, при этом результаты считалисьстатистически значимыми при p<0,05, а наиболее удачной принималась модель снаименьшим значением информационного критерия Акаике (AIC) [259].Для анализа количественных признаков предварительно была выполненапроверка нормальности их распределения в изучаемых выборках с использованием51критерия Шапиро-Уилка.

В связи с тем, что распределение количественныхпризнаков в большинстве выборок отличалось от нормального, при их описанииуказывались медиана (Me) и интерквартильный размах (25-й (Q1) и 75-йпроцентили (Q3)), а наличие различий в выборках определялось с помощью Uкритерия Манна-Уитни (для 2 независимых выборок) или критерия Вилкоксона(для 2 зависимых выборок) [14]. Учитывая, что показатели спонтанной продукцииTNFα, IL1β и IL10 в культуре клеток цельной крови и показатели IL1β и IL10 всыворотке крови в большинстве случаев имели одинаковые значения, равныенулю, а общий объем выборки был более 20 человек, при сравнительном анализеучитывалсяU-критерий,скорректированныйнаналичиясвязок,ссоответствующим уровнем значимости.

В то же время при сравнении показателеймитоген-индуцированной продукции TNFα, IL1β и IL10, а также всех показателейIL6 U-критерий не корригировался на наличие связок, а уровень значимостирассчитывался точным способом. Для оценки наличия взаимосвязи двухколичественных признаков между собой проводился корреляционный анализ сприменением критерия Спирмена: связь считали прямой при R>0, обратной – приR<0, сильной – при |R|>0,7, умеренной – при 0,5<|R|<0,7, слабой – при 0,3<|R|<0,5[194].Во всех случаях различия считались статистически значимыми при р<0,05.С учетом наличия множественных сравнений проводилась коррекциязначений p путем применения «ресемплинга» методом Монте-Карло c числомитераций 107 (для количественных признаков) или пермутационного теста с числомпермутаций104(длятаблицысопряженности)(pcor–обозначениескорректированного уровня p) [147, 177, 303].Исследованиеролимежгенныхвзаимодействийвформированиинаследственной предрасположенности к развитию ЮИА проводилось с помощьюалгоритма снижения размерности «multifactor dimensionality reduction» впрограмме MDR v.3.0.2 [193].

Анализировались двух-, трех- и четырехлокусныемодели (собственно ген-генные взаимодействия), а также однолокусные модели.Определение наиболее удачных моделей проводилось в автоматическом режиме52методом «exhaustive search» (при значении показателя воспроизводимости моделименее 90% (9/10) результаты валидировались методом «forced search»). Приотсутствии статистически значимых различий между частотами сочетанийгенотипов в сравниваемых группах (оценка с помощью точного двустороннегокритерия Фишера, порог отсечения 0,05), соответствующие сочетания относилиськ категории «неклассифицируемые». Оценка статистической значимости моделейпроводилась с помощью пермутационного теста с числом пермутаций 103 (pcor).Качество модели определялось по значению показателей скорректированнойсбалансированной точности тестирования (минимальный порог - 0,55) ивоспроизводимости модели (минимальный порог - 90%).

Информационныйприрост (information gain), наблюдаемый при исследовании генотипов одного илидвух локусов (попарный анализ), оценивался по уровню снижения энтропии. Наосновании полученных данных проводился кластерный анализ, позволяющийстроить дендограмму взаимодействия локусов. Для визуализации результатов всехпопарных сравнений строился граф взаимодействия.53ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ3.1 Клиническая характеристика больных ювенильным идиопатическимартритомПри оценке половозрастной структуры группы пациентов с ЮИА былоустановлено почти двукратное преобладание девочек (65,76%) (Таблица 2).Медиана возраста обследованных больных на момент включения висследование составила 9,05 (4,99;13,30) лет. Медиана возраста дебюта ЮИА быларавна 4,30 (2,32;8,25) лет, а мода – 3,00 лет.

При этом у девочек заболеваниеманифестировало значительно раньше, чем у мальчиков (медиана возраста дебюта ‒3,36 (2,00;7,20) лет и 6,31 (3,44;9,40) лет соответственно, p=0,00007, pcor=0,00006).Медиана продолжительности болезни на момент включения пациентов висследование составила 2,48 (0,59;6,30) лет.При подразделении больных согласно классификации ILAR наиболеемногочисленными оказались следующие варианты ЮИА: олигоартикулярные(персистирующий (29,70%) и распространившийся (13,94%)), РФ-негативныйполиартикулярный (26,06%) и энтезит-ассоциированный (10,61%).Для отдельных вариантов ЮИА наблюдалась специфическая половозрастнаяструктура с преобладанием девочек в большинстве случаев.