Диссертация (Молекулярно-генетические основы ювенильного артрита), страница 8

улучшения на 30% в сравнениис исходным значением не менее чем трех из шести ключевых показателей привозможном ухудшении на 30% не более чем одного ключевого показателя [8, 229].В то же время ответ считался достаточным только в случае достижения пациентоммедикаментозной клинической ремиссии по критериям Wallace et al. (2011) [8, 34,287, 300].При оценке лабораторных показателей повышением уровня СОЭ и СРБсчиталось превышение нормы в 2 и более раз.41Рисунок 4 ‒ Классификация терапевтических групп ЮИА согласнорекомендациям ACR (2011) [20]Рисунок 5 ‒ Оценка эффективности терапии ЮИА [8, 229, 287]Следует отметить, что оценка клинических показателей у части пациентов непроводиласьиз-заотсутствия/неоднозначностиданныханамнезаи/илинедостаточной длительности и регулярности терапии, а также ее переносимости.Отбориндивидовпредварительногоопросника.вконтрольнуюанкетированиясгруппупомощьюпроводилсяспециальнопослеихразработанного42Выкопировка данных из медицинской документации и опросниковпроводилась непосредственно в электронные таблицы, специально разработанныеавтором с помощью программы MS Excel.Экспериментальные методы исследованияЭкспериментальные исследования проводились в научно-исследовательскойлаборатории кафедры биологии и в «Лаборатории молекулярной генетики» (с 2015года ‒ подразделение «Лаборатории клеточных культур») центральной научноисследовательской лаборатории ФГБОУ ВО БГМУ Минздрава России.Первичнымбиологическимматериаломдляпоследующихэкспериментальных исследований служила периферическая венозная кровьиндивидов.Молекулярно-генетические методы исследованияВыделение ДНКОбразцы крови для выделения ДНК отбирались из вены в вакуумныепробирки с этилендиаминтетраацетатом (ЭДТА) или цитратом натрия в объеме 0,58 мл и далее хранились при -20°С не более 6 месяцев.

Экстракция ДНК проводиласьстандартным фенольно-хлороформным методом с модификациями (микрометод)[187].Измерение концентрации ДНК проводилось на микроспектрофотометреNanoPhotometer™ P-330, Implen (Германия). Для последующего использованияподготавливались «рабочие» аликвоты образцов, доведенные до концентрацииДНК 100 нг/мкл путем разбавления исходной ДНК деионизированной водой.Генотипирование индивидов по полиморфным локусамГенотипирование индивидов основной и контрольной групп по полиморфнымлокусам генов медиаторов иммунного ответа (TNFA, LTA, IL1B, IL2RA, IL6, IL10,MIF, CTLA4, NFKB1, PADI4, PTPN22) и межгенной области (IL2-IL21) проводилось43с использованием следующих методов: полимеразная цепная реакция синтеза ДНК(ПЦР), ПЦР с анализом полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (ПДРФанализ), ПЦР с аллель-специфичными праймерами (с электрофоретическойрегистрацией результатов для трех перечисленных методов), а также ПЦР сиспользованием специфических флуоресцентно-меченых зондов (TaqMan) иавтоматической регистрацией результатов в режиме реального времени (ПЦР вреальном времени, ПЦР-РВ).Характеристика изученных полиморфных локусов с указанием методов иханализа приведена в Таблице 1.Проведение ПЦР, ПЦР с ПДРФ-анализом, ПЦР с аллель-специфичнымипраймерами с электрофоретической регистрацией результатовДля проведения ПЦР, ПЦР с ПДРФ-анализом, ПЦР с аллель-специфичнымипраймерами (с последующей электрофоретической регистрацией результатов)использовался ДНК-амплификатор «Терцик» (ООО «ДНК-Технология», Россия).В состав стандартной реакционной смеси для ПЦР объемом 25 мкл входилиследующие компоненты: 2,5 мкл реакционного буфера (состав: 60 мМ Tris-HCl (pH8,5 при 25°C) + 1,5 мМ MgCl2 + 25 мМ KCl + 10 мМ 2-меркаптоэтанол + 0,1%Тритон X-100; производство НПО «Сибэнзим», Россия); 1,0 мкл 5 мМ смесидезоксинуклеозидтрифосфатов(НПО«Сибэнзим»,Россия);по2,0мклспецифических олигонуклеотидных праймеров концентрацией 1 ОЕ/мл; 1,0 мклгеномной ДНК с концентрацией 100 нг/мкл; 0,2 мкл Taq-полимеразы сконцентрацией 5 единиц активности на мкл (НПО «Сибэнзим», Россия);деионизированная вода до 25 мкл.Последовательностиопределялисьсспецифическихпомощьюлитературныхолигонуклеотидныхданныхилипраймеровподбиралисьсиспользованием программ GeneTool Lite 1.0 (BioTools, Inc.), Oligo Analizer 1.0.2 (©T.

Kuulasmaa) и PrimerQuest (Integrated DNA Technologies, Inc.) [170, 232, 305].44Таблица 1 ‒ Характеристика изученных локусов и условий их анализаПолиморфныйлокусПоследовательности праймеров и зондов12rs1800629(-308G>A)TNFArs909253(252A>G)LTArs16944(-511C>T)IL1Brs6822844(G>T)IL2-IL21-308G>ATNFA5’-AATAGGTTTTGAGGGCCATG-3’5’-TCCTCCCTGCTCCGATTCCG-3’ТемператураГенотипыотжига(размер фрагментов, парпраймеров,нуклетотидов (п.н.) /°Скраситель)345GG – 87 п.н.ПЦР-ПДРФ53GA – 107+87+20 п.н.Bsp19IAA –107 п.н.Методанализа,фермент5’-GACTGATTTGTGTGTAGGACCCT-3’5’-GAAACAGACCACAGACCTGGT-3’5’-FAM-CCGTCCTCATGCCC-BHQ1-3’5’-VIC-CCGTCCCCATGCC-BHQ1-3’ПЦР-РВ5’-CTCCTGCACCTGCTGCCTGGATC-3’5’-GAAGAGACGTTCAGGTGGTGTCAT-3’55GG – VICGA – VIC/FAMAA – FAMПЦР-ПДРФBsp19I57AA – 368 п.н.AG – 368+235+133 п.н.GG – 133 п.н.5’-GCAGAGGGAGACAGAGAGAGACA-3’5’-CTGACTCTCCATCTGTCAGTCTCA-3’5’-FAM-AGAGAGGAACCATGGCAGA-BHQ1-3’5’-VIC-GGGAACAGAGAGGAATCATG-BHQ1-3’ПЦР-РВ55AA – VICAG – VIC/FAMGG – FAM5’-TGGCATTGATCTGGTTCATC-3’5’-GTTTAGGAATCTTCCCACTT-3’ПЦР-ПДРФAma87I55CC – 190+114 п.н.CT – 304+190+114 п.н.TT – 304 п.н.55CC – VICCT – VIC/FAMTT – FAM62G – 393 п.н.61T – 393 п.н.5’-GAGGGTGTGGGTCTCTACCTT-3’5’-CCCAGCCAAGAAAGGTCA-3’5’-FAM-CTGCCTCAGGAGCTCT-BHQ1-3’5’-VIC-GCCTCGGGAGCTCT-BHQ1-3’F1: 5’-GCATGCACAGGAGAAACAGAT-3’R: 5’-CTCGCTCTCCATAGCAAATAG-3’F2 : 5’-GCATGCACAGGAGAAACAGAT-3’R : 5’-CTCGCTCTCCATAGCAAATAT-3’5’-AATAGGTTTTGAGGGCCATG-3’5’-TCCTCCCTGCTCCGATTCCG-3’ПЦР-РВАллельспецифичнаяПЦР62/61Внутренний контроль107 п.н.Ссылка6[294]ООО «ДНКСинтез»[122]ООО «ДНКСинтез»[158]ООО «ДНКСинтез»[170, 232, 305]45Продолжение Таблицы 1125’-TGTATGCCCTGTCTCGCTCT-3’rs68228445’-GTAGCTCACACAGGGCATTTACA-3’(G>T)5’-FAM-AGCAAAAAGAGAGGACTC-BHQ1-3’IL2-IL215’-VIC-TAGCAAAAATAGAGGACTC-BHQ2-3’rs2104286(A>G)IL2RArs1800795(-174G>C)IL6rs1800872(-592C>A)IL10rs3087243(G>A)CTLA4345ПЦР-РВ55GG – FAMGT – FAM/VICTT – VIC5’-AAGGTTGCAGTGAGTTGAGA-3’5’-GGTTGAGCGACTTTTGTGTA-3’ПЦР-ПДРФFauNDI58GG – 696 п.н.AG – 395+301 п.н.AA – 301 п.н.5’-CTGATAGCCCCATGCTCAGT-3’5’-AGTTGGTGAGGAGGAGAAAGG-3’5’-FAM-ACCACATACGACTTGTG-BHQ1-3’5’-VIC-TACCACATATGACTTGTGT-BHQ2-3’ПЦР-РВ55GG – FAMGA – FAM/VICAA – VIC5’-TGACTTCAGCTTTACTCTTTGT-3’5’-CTGATTGGAAACCTTATTAAG-3’ПЦР-ПДРФHin1II58GG – 167+31 п.н.GC – 167+122+45+31 п.н.CC – 122+45+31 п.н.55GG – FAMGC – FAM/VICCC – VIC5’-CGACCTAAGCTGCACTTTTCC-3’5’-TGGAAACCTTATTAAGATTGTGCA-3’5’-VIC-GTCTTGCCATGCTAAA-BHQ2 -3’5’-FAM-TGTCTTGCGATGCTAAAG-BHQ1-3’ПЦР-РВ5’-AACTTCTTCCACCCCATCTTT-3’5’-ATCCTCAAAGTTCCCAAGCAG-3’ПЦР-ПДРФRsaI58CC – 412 п.н.CA – 412+262+150 п.н.AA – 262+150 п.н.5’-GTAAAGGAGCCTGGAACACAT-3’5’-ATCCTCAAAGTTCCCAAGCA-3’5’-FAM-TCCTACAGTACAGGCG-BHQ1-3’5’-VIC-TCCTACAGGACAGGC-BHQ1-3’ПЦР-РВ55CC – VICCA – VIC/FAMAA – FAM5’-TGGCTGCAAGGGACGTGGTT-3’5’-CATGGACAGAAGAAGGCAGCAG-3’ПЦР-ПДРФTaiI64AA – 552 п.н.AG – 552+389+163 п.н.GG – 389+163 п.н.5’-CCAATTGATTTATAAAGGACTGCT-3’5’-CTTGGAAGGTATCCATCCTCTT-3’5’-FAM-TAACCCACGTTATATCC-BHQ1-3’5’-VIC-TTAACCCATGTTATATCC-BHQ1-3’ПЦР-РВ55GG – FAMGA – FAM/VICAA – VIC6ООО «ДНКСинтез»[170, 232, 305]ООО «ДНКСинтез»[274]ООО «ДНКСинтез»[153]ООО «ДНКСинтез»[170, 232, 305]ООО «ДНКСинтез»46Продолжение Таблицы 11rs28362491(-94I>D)NFKB1rs755622(-173G>C)MIFrs2476601(1858G>A)PTPN22rs2240336(G>A)PADI42345’-GGACCGCATGACTCTATCAGC-3’5’-CCGAATCCCAAGGGCTGGAG-3’ПЦР60II – 131 п.н.ID – 131+127 п.н.DD – 127 п.н.ООО «ДНКСинтез»ПЦР-РВ55II – VICID –VIC/FAMDD – FAMООО «ДНКСинтез»ПЦР-РВ57GG – FAMGC – FAM/VICCC – VICООО «ДНКСинтез»ПЦР-РВ55GG – FAMGA – FAM/VICAA – VICООО «ДНКСинтез»ПЦР-РВ55AA – FAMGA – FAM/VICGG – VICООО «ДНКСинтез»5’-CCGCCTCCGTGCTGCCT-3’5’-CAAGGGCTGGAGCCGGTA-3’5’-FAM-CCGACCATTGGGCCCGG-BHQ1-3’5’-VIC-CCGACCATTGATTGGGCCC-BHQ1-3’5’-CTCCAGCAACCGCCGCTA-3’5’-GAAAGGACTAAGAAAGACCCGA-3’5’-FAM-CTCCAACCTGTTCTCC-BHQ1-3’5’-VIC-CTCCAAGCTGTTCTC-BHQ2-3’5’-ССAGCTTCCTCAACCACAATAAATG-3’5’-CAACTGCTCCAAGGATAGATGATGA-3’5’-FAM-TCAGGTGTCCGTACAGG-BHQ1-3’5’-VIC-TCAGGTGTCCATACAGG-BHQ2-3’5’-ATCCTGTGGGAGTGAGTGGA-3’5’-GGTGAGAGTGAGTGGATGGTT-3’5’-FAM-TTGCGCATGCTGCC-BHQ1-3’5’-VIC-TTGCGCGTGCTGC-BHQ1-3’5647Общая схема программ для проведения ПЦР включала следующие этапы:предварительная денатурация (93-95oC, 2-5 мин), 30-40 циклов амплификации(денатурация (93-95oC, 20-30 сек), отжиг праймеров (56-68oC, 20-30 сек), синтез(72oC, 20-30 сек)), завершающий синтез (72oC, 2-5 мин).Для определения температуры отжига праймеров (Tm) использовали формулу,учитывающую входящие в их состав нуклеотиды:Tm = [2*(A+T) + 4*(G+C)]oC.В отдельных случаях температуру отжига праймеров уточняли эмпирически.Синтез праймеров по заданной последовательности нуклеотидов осуществлялся наавтоматических синтезаторах фирмы «Синтол», Россия.Для генотипирования полиморфного локуса IL2-21 rs6822844 проводиласьПЦР с аллель-специфичными праймерами.

Были подобраны три праймера (двапраймера, содержащих изучаемый полиморфный фрагмент с альтернативнымиаллелями (F1 (G) и F2 (T)), один праймер (R) ‒ не содержащий данный фрагмент),а амплификацию проводили дважды: сначала с парой праймеров F1 и R, а затем ‒с F2 и R.

При отсутствии соответствующего аллеля реакция ингибировалась. Вкачестве внутреннего контроля использовались праймеры к полиморфному локусуTNFA rs1800629.Для проведения ПДРФ-анализа амплифицированные фрагменты подвергалисьгидролизу специально подобранными эндонуклеазами рестрикции (рестриктазами)фирм «Fermentas» («Thermo Fisher Scientific») (Латвия) и «Сибэнзим» (Россия).