Диссертация (Диагностическое значение определения особенностей митохондриальной ДНК при энцефаломиопатиях у детей), страница 13

Тепловая карта экспрессии 199 генов, ассоциированных с работоймитохондрий, для 48 пациентов.90Черный цвет соответствует среднему значению экспрессии гена, желтый –сниженному значению, голубой – повышенному значению. Интенсивность цветапропорциональна степени изменения значения относительно среднего. Повертикальной оси расположены кластеры генов, по горизонтальной – кластерыпациентов.Согласно карте на рисунке 3.17 среди индивидуальных профилей экспрессиив исследуемой выборке пациентов выделяются три основные группы, в целомсоответствующие трем выбранным нозологическим формам. Кластеры пациентовс мышечными дистрофиями и врожденными миопатиями обладают значительнымсходствоммеждусобойпосравнениюскластеромпациентовсмитохондриальными энцефаломиопатиями.

Особый интерес представляют 7пациентов из группы 1 (мтЭМП), которые были отнесены кластерным анализом кдвум другим группам: четверо к группе 2 (МД), трое – к группе 3 (ВМ).Среди генных кластеров в особенности выделялось два, представленных нарисунках 3.18 и 3.19. Первый состоял из 59 генов, второй – из 7. В них четкопрослеживаются различия между тремя группами профилей пациентов.91Рисунок 3.18. Фрагмент тепловой карты со значениями 59 генов у 48 пациентов.По вертикальной оси расположены гены, в порядке, согласно кластерномуанализу; по горизонтальной – кластеры пациентов.Рисунок 3.19. Фрагмент тепловой карты со значениями 11 генов у 48пациентов. По вертикальной оси расположены гены, в порядке, согласнокластерному анализу; по горизонтальной – кластеры пациентов.92Обсуждение значимости построения тепловой картыАнализ полученного в исследовании большого массива данных с помощьютепловой карты позволил предварительно визуализировать основные результаты.Во-первых, было выделено 3 кластера генов со схожим паттерном экспрессии (рис.3.18 и 3.19).

Существенным недостатком статистической логики построениятепловой карты является отсутствие требования достоверности различия междугруппами образцов для каждого из генов, входящего в кластер. В этой связи,выборка генов требует дополнительного анализа с помощью параметрических инепараметрических статистических критериев для верификации значимостиразличия.

Однако при работе с генами, для экспрессии которых существуютдостоверные данные о различиях между здоровыми и больными людьми или междупациентами с различными нозологическими формами, тепловая карта будетсамодостаточным инструментом для оценки количественных характеристикматричной РНК в исследуемой ткани.Вторым важнейшим результатом стало формирование кластеров пациентов,отличающихся от предварительно составленных. Первичное разделение пациентовна группы было проведено согласно результатам клинического обследования (т.е.анализа фенотипа). Пациенты с шифрами 20, 21, 22 и 23 были изначальновключены в группу митохондриальных энцефаломиопатий, однако кластерныйанализ отнес их к группе пациентов с мышечными дистрофиями.

Пациенты сшифрами 24, 25, 27 при планировании исследования входили в группу мтЭМП, нопри построении тепловой карты обнаружили больше сходства с пациентами,страдающими от ВМ.Природа этой реаранжировки была выяснена при сопоставлении срезультатами лабораторного патоморфологического анализа мышечного биоптата,который явился биоматериалом для выделения РНК в нашем исследовании.Установлено соответствие между морфологическими структурными нарушениямимышечной ткани и паттернами экспрессии генов в ней.

Действительно, у пациентовс шифрами 20-25 и 27 гистохимические признаки митохондриальных нарушений93были выражены слабо либо отсутствовали вовсе. При этом, для пациентов 20-23были выявлены патологические изменения со стороны соединительнотканныхоболочек, мышечных ядер и мионов в целом, которые соответствовали картинемышечной дистрофии. Для пациентов 24, 25 и 27 диагностированы измененияразмера и распределения митохондрий в мышечных волокнах, характерные дляВМ.Таким образом, кластеризация при построении тепловой карты обладаетсущественным диагностическим потенциалом. С помощью этого инструментавозможно не только уточнить предварительный клинический диагноз иподтвердить результаты гистохимического анализа биоптата, но и оценитьколичественное содержание сотен молекулярных маркеров.3.2.3.

Визуализация данных с помощью диаграмм рассеянияВажнейшим инструментом визуализации больших массивов данныхэкспрессии генов являются точечные диаграммы или диаграммы рассеяния. Онибыли построены для трех групп пациентов, в соответствии с результатамикластерного анализа, не опираясь в дальнейшем на предварительный клиническийдиагноз. Согласно диаграммам на рисунке 3.20, 3.21 и 3.22 профили экспрессиипациентов, отнесенных в группы 1, 2 и 3 соответственно, крайне схожи.Шкалы диаграмм представляют собой двоичный логарифм значенияэкспрессии генов по оси Х – для одного из образцов рассматриваемой группы, пооси Y – для остальных образцов данной группы.

Результаты анализа экспрессиигенов каждого пациента обозначены определенным типом символов и цветом,каждый такой символ соответствует одному гену в представленных координатах.94Рисунок 3.20. Диаграмма рассеяния значений экспрессии генов в группе 1.По оси Х – двоичный логарифм от значений экспрессии генов одного из пациентов группы 1;по оси Y – двоичный логарифм значений экспрессии остальных пациентов из группы 1.Рисунок 3.21. Диаграмма рассеяния значений экспрессии генов в группе 2.По оси Х – двоичный логарифм от значений экспрессии генов одного из пациентов группы 2;по оси Y – двоичный логарифм значений экспрессии остальных пациентов из группы 2.95Рисунок 3.22.

Диаграмма рассеяния значений экспрессии генов в группе 3.По оси Х – двоичный логарифм от значений экспрессии генов одного из пациентов группы 3;по оси Y – двоичный логарифм значений экспрессии остальных пациентов из группы 1.Значения экспрессии практически всех генов для пациентов каждой группырасполагаются линейно с минимальным количеством отклоняющихся значений.Таким образом, внутри выявленных нами кластеров экспрессия практическикаждого из генов панели однородна. Это подтверждает результаты кластерногоанализа и построения тепловой карты.Диаграммы рассеяния также были построены для каждой группы пациентовотносительнодвоичногологарифмазначенийэкспрессиипациентаизнеродственного кластера (рис.

3.23, 3.24, 3.25). На этих графических изображенияхочевидны различия между значениями экспрессии генов пациентов разных групп:массив теряет линейность; количество генов, существенно отличающихся отсреднего значения по группе, значительно больше.96Рисунок 3.23. Диаграмма рассеяния значений экспрессии генов в группе 2относительно группы 1.По оси Х – двоичный логарифм от значений экспрессии генов одного из пациентов группы 1;по оси Y – двоичный логарифм значений экспрессии остальных пациентов из группы 2.Рисунок 3.24.

Диаграмма рассеяния значений экспрессии генов в группе 1относительно группы 2.По оси Х – двоичный логарифм от значений экспрессии генов одного из пациентов группы 1;по оси Y – двоичный логарифм значений экспрессии остальных пациентов из группы 2.97Рисунок 3.25. Диаграмма рассеяния значений экспрессии генов в группе 3относительно группы 1.По оси Х – двоичный логарифм от значений экспрессии генов одного из пациентов группы 3;по оси Y – двоичный логарифм значений экспрессии остальных пациентов из группы 1.Обсуждение применимости диаграмм рассеянияАнализ точечных диаграмм рассеяния, как и в случае тепловых карт, можетбыть использован для предварительной оценки однородности массивов данныхнескольких пациентов. В отличие от существующих диагностических методов,анализ экспрессии генов позволяет единовременно работать с сотнямимолекулярно-генетических маркеров.

Даже визуальный анализ распределениятакого количества показателей сам по себе является мощным инструментом дляопределения принадлежности отдельного пациента к общей выборке или длявыявления сильно различающихся значений РНК-маркеров. Безусловно, различияв экспрессии генов между разными группами пациентов требуют статистическойверификации.

Однако при работе с ранее изученными генами, дифференциальнаядиагностика возможна и на базе описанных диаграмм.983.2.4. Статистический анализ экспрессии геновПроанализировав с помощью построения тепловой карты и диаграммрассеяния общие паттерны экспрессии генов и подразделив пациентов на наиболеекорректные с точки зрения клеточных маркеров группы, нормированный массивданных был подвергнут статистической обработке. С помощью непараметрическихкритериев Манна-Уитни и Колмогорова-Смирнова были выявлены группы генов,значения которых достоверно различались у пациентов с разными формаминервно-мышечных заболеваний (таблицы 3.15-3.17).