Диссертация (Диагностическое значение определения особенностей митохондриальной ДНК при энцефаломиопатиях у детей), страница 12

Обсуждение взаимосвязи элементов клинической картины сгаплогруппой пациентовКак известно, гаплогрупповые полиморфизмы сами по себе безвредны,поскольку представляют собой результат молекулярной селекции, направленнойна адаптацию организма к измененным условиям внешней среды [92].Наследственное закрепление определенного гаплотипа происходит лишь приусловии модификации системы клеточного дыхания, например окислительногофосфорилирования, в сторону увеличения эффективности этого процесса дляжизнедеятельностиорганизма-носителя[93].Наилучшимобразомэтодемонстрируют этнические изоляты, которым присущи высокоспецифичные, апорой и уникальные митохондриальные гаплогруппы, а также соответствующие имметаболические особенности [67].Однако существуют и постоянно приумножаются научные данные,свидетельствующие о том, что митохондриальная гаплогруппа может служить81неким «фоном» для проявления тех или иных заболеваний [47], [2], или напротив,являться защитным фактором [33].Так, принято считать, что гаплогруппа J приводит к митохондриальномуразобщению или свободному окислению [34].

Это явление, при котором переносэлектронов по дыхательной цепи слабо сопряжен с фосфорилированием АДФ. Врезультате, энергия, генерируемая при окислении, выделяется в виде теплоты.Свободное, неокислительное фосфорилирование является одним из механизмовтерморегуляции. В организме человека в норме имеется специальная ткань – бурыйжир (особенно развитый в постнатальном периоде), митохондрии которогоработают по разобщающему принципу [23]. Предположительно, гаплогруппа Jвозникла в качестве адаптации к низкому температурному режиму [8].

Однако, принеобходимости высокого уровня продукции АТФ, данная группа являетсяфактором риска. Вероятно, два возможных состояния сердечно-сосудистойсистемы: нормальное и тяжелая патология, и в то же время отсутствие нарушенийумеренной степени – являются следствием именно разобщающей способностигенома данных пациентов. Более частое проявление нарушений такогоэнергозатратного процесса, как дыхание, в определенной степени также можетбыть связано с этой особенностью гаплотипа J.Гаплогруппы U и T в нашем исследовании проявляют скорее протективныесвойства.

Пациенты с U-принадлежностью, судя по всему, более устойчивы кпоражению головного мозга: у них реже диагностируется мигрень и умственнаяотсталость. У пациентов с гаплогруппой T еще меньше выражена симптоматикамитохондриальных нарушений: среди них существенно ниже процент нарушенийфизического развития, а нервно-мышечный симптомокомплекс и повышениелактатдегидрогеназы в крови не выявлены вовсе.Наиболее сложная система взаимосвязей наблюдается у пациентов сгаплогруппой HHV (в частности, также – с гаплогруппой Н). С одной стороны, вэтой группе реже встречаются нарушения почек, повышенный уровеньаланинаминотрансферазы, а также предположительно патогенный вариант82C12562G. С другой стороны, генетический вариант A10732T и предположительноассоциированные с ним нарушения поджелудочной железы выявляются средиHHV-пациентов достоверно чаще.Согласно полученным данным, гаплогрупповая принадлежность может бытьассоциирована как с отдельными элементами клинической картины пациента, таки с конкретными генетическими вариантами.

Безусловно, размер выборки, накоторой проводилась данная работа, не позволяет делать окончательных выводовотносительно описываемых взаимосвязей. Однако, факт выявления достоверныхразличий даже при небольшом количестве пациентов, ярко иллюстрирует какнаучную, так и диагностическую необходимость анализа гаплогрупповойпринадлежности пациента. Следует особо подчеркнуть, что требуемая глубинаанализаможетбытьдостигнутатолькоприсеквенированииполнойпоследовательности митохондриальной ДНК.3.2.

Анализ экспрессии митохондриальных генных сетейВ ходе выполнения исследования проведен анализ экспрессии 207 генов (см.приложение), ассоциированных с работой митохондрий, у 48 неродственныхиспытуемых,направленныхотделениямиклиническойгенетикиипсихоневрологии и эпилептологии Научно-Исследовательского КлиническогоИнститута Педиатрии имени академика Ю.Е. Вельтищева РНИМУ им.

Н.И.Пирогова.29 пациентов относились к группе с клиническим подозрением намитохондриальную энцефаломиопатию (мтЭМП). Эти пациенты также входили ввыборку, для которой проводилось секвенирование митохондриальной ДНК(результаты анализа представлены в предыдущем разделе). В качестве группысравнения были отобраны пациенты с нервно-мышечными заболеванияминемитохондриального генеза: 13 пациентов с клиническим подозрением намышечную дистрофию (МД) и 6 пациентов с подозрением на врожденнуюмиопатию (ВМ). В патогенез некоторых из этих заболеваний также входятнарушения митохондриальной функции, однако они носят вторичный характер.

У83всех 19 пациентов референсной группы были найдены патогенные мутации вядерных генах структурных элементов мышечных волокон и внеклеточногоматрикса. Таким образом, предполагалось сравнить распределение динамическихРНК-маркеров митохондриальных генных сетей для первичных и вторичныхмитохондриальных нарушений при нервно-мышечной симптоматике.В группу митохондриальных больных (далее – группа 1) вошло 13 пациентовмужского и 16 женского пола; в группу пациентов с мышечной дистрофией (далее– группа 2) входило 6 пациентов мужского пола и 7 женского; в группу пациентовс врожденными миопатиями (далее – группа 3) – 2 мужского и 4 женского пола.Статистически значимых различий в половом распределении выборки невыявлено.

Возраст пациентов составлял от 1 года до 12 лет, средний возраст – 2года и 4 месяца.3.2.1. Оценка качества анализа экспрессии геновКачество анализа оценивалось для каждого образца в отдельности и для всейвыборки с помощью системы внутренних контролей, унифицированныхпроизводителем, и генов домашнего хозяйства, выбранных нами в процесседизайна панели.Положительныйконтрольпредставлялсобойсериюизшестипоследовательных разведений синтетической РНК-молекулы. Разброс значенийколичественного содержания этих молекул оценивался для каждого запускасистемы (т.е.

для каждых 12 образцов, которые анализировались приборомодновременно), а также для всей выборки в целом. Впоследствии данные одисперсиибылииспользованыдлястатистическойнормировкиэкспериментальных данных. Значения положительных контролей соответствовалистандартам качества, заявленным производителем для данного вида анализа как поколичественному соотношению в образцах, так и по величине дисперсий (рисунок3.13).Отрицательные контроли представляли собой синтетические молекулы РНК,спроектированные таким образом, чтобы используемые в панели зонды физически84не могли гибридизоваться с ними. Эти образцы служили для выявления фоновогоуровня флуоресценции и при обработке данных были использованы дляустановления порогового значения экспрессии целевых генов. Значения,полученные для отрицательных контролей и их дисперсии, представлены нарисунке 3.14.На рисунке 3.15 представлены результаты комплексной оценки качестваанализа, в том числе системы положительных и отрицательных контролей,качества конъюгации образцов на картридж (плотность связывания), качестваработы микроскопа в цифровом анализаторе.

Для всех генов в каждом из 48образцовотображеноколичество«чтений»–соответствующихметок,детектированных анализатором. В соответствии со значениями отрицательныхконтролей, гены, для которых было выявлено недостаточное количество чтений,исключались из обработки. Всего было исключено 8 генов.85Рисунок 3.13. Количественное содержание серии разведенийположительных контролей в 48 исследованных образцах.По оси Y представлено количество «чтений» – условных единицколичественного измерения уровня экспрессии гена.Рисунок 3.14. Количественное содержание серии отрицательных контролейв 48 исследованных образцах.По оси Y представлено количество «чтений» – условных единицколичественного измерения уровня экспрессии гена.86Качество + контроляПлотность связыванияКачество снимковКоличество чтений:Значение £отрицательногоконтроляРисунок 3.15.

Визуализация результатов анализа для 48 образцов.Оранжевым отмечены гены, для которых было произведено более 500чтений; коричневым – от 100 до 500 чтений; серым – от 50 до 100; голубым – от25 до 50; синим – менее 25 чтений.В верхней части рисунка находятся критерии, по которым оценивалоськачество реакции гибридизации, работы станции пробоподготовки и работыцифровогоанализатора:системаположительныхконтролей,плотностьсвязывания, качество работы микроскопа. В случае, если один из этих критериевне соответствовал заданному производителем уровню качества, образец помечалсяфиолетовым сектором (на рисунке не представлено).

В случае полногосоответствия контролю образец помечался желтым. Полоса в левой части рисункаотображает результаты работы с отрицательными контролями, т.е. исключениегенов с низкими значениями экспрессии.87Образцы кластеризованы в соответствии с паттернами чтений цифровогоанализатора.Также для нормировки значений экспрессии в разных образцах в дизайнпанели было включено 6 генов домашнего хозяйства, выбранных на основе данныхлитературы, как наиболее часто используемые при анализе РНК. Значения,полученные для этих генов, представлены на рисунке 3.16.Из статистической обработки был исключен ген ACTB, так как дисперсиязначений экспрессии этого гена велика и достоверно различалась между группамиобразцов (между группами 1 и 2 по критерию Манна-Уитни р=0,029, Z=-2,073; покритериюКолмогорова-Смирновар=0,05,Z=1,249).Уровеньэкспрессииостальных генов: GAPDH, HPRT1, RPL19, TUBB, VPS29 – соответствоваложиданию и рекомендуемому значению коэффициента нормализации (см.

раздел«Материалы и методы»).Рисунок 3.16. Количественное содержание генов домашнего хозяйства в 48исследованных образцах.По оси Y представлено количество «чтений» – условных единицколичественного измерения уровня экспрессии гена.883.2.2. Построение тепловой карты экспрессии геновПосле нормирования данных результаты анализа 199 генов 48 пациентовбыли визуализированы в виде тепловой карты (рис. 3.17).Тепловая карта строится следующим образом: вначале высчитываетсясреднее значение экспрессии гена по общей выборке пациентов, затемпроизводится подсчет отклонения значения этого гена от среднего для каждогопациента. Полученные результаты визуализируются в виде матрицы, столбцысоответствуют пациентам, а строки – исследуемым генам. Каждому пересечениюприсваивается один из трех цветов и определенная интенсивность цвета.

Черныйцвет соответствует среднему значению по выборке. Желтый цвет обозначает гены,экспрессия которых снижена относительно среднего значения, голубой цвет – геныс повышенной экспрессией. Интенсивность цвета пропорциональная степениотклонения от среднего: чем ярче цвет, тем сильнее изменение.И пациенты, и гены подвергаются кластеризации на основе сходстваполученных значений отклонения от среднего. Иерархические древа для образцови генов представлены на рисунке 3.17 сверху и слева соответственно. Колонки истроки со схожими значениями размещаются рядом. При этом, однако, не все геныкластеров имеют статистически значимый уровень различий.Тепловая картаслужит, в первую очередь, для визуализации и понимания больших массивовданных об экспрессии генов и позволяет провести общую оценку картины длякаждого пациента или какой-либо группы.89Рисунок 3.17.