Диссертация (Диагностическое значение определения особенностей митохондриальной ДНК при энцефаломиопатиях у детей)

Обособленное структурное подразделение«Научно-исследовательский клинический институт педиатрии имениакадемика Ю.Е. Вельтищева» федерального государственного бюджетногообразовательного учреждения высшего образования «Российскийнациональный исследовательский медицинский университет имени Н.И.Пирогова» Министерства здравоохранения Российской федерацииНа правах рукописиВоронкова Анастасия СергеевнаДИАГНОСТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ ОПРЕДЕЛЕНИЯОСОБЕННОСТЕЙ МИТОХОНДРИАЛЬНОЙ ДНК ПРИЭНЦЕФАЛОМИОПАТИЯХ У ДЕТЕЙ14.03.10 – клиническая лабораторная диагностика03.02.07 – генетикаДИССЕРТАЦИЯна соискание ученой степени кандидата биологических наукНаучные руководители:Доктор медицинских наук, профессорСухоруков Владимир СергеевичДоктор биологических наук, профессорЩербо Сергей НиколаевичМосква – 20182ОГЛАВЛЕНИЕВВЕДЕНИЕ5ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ111.1.

Структура и функции митохондрий111.2. Митохондриальная биоэнергетика121.3. Окислительное фосфорилирование и электрон-транспортная цепьмитохондрий131.4. Генерация активных форм кислорода151.5. Митохондриальная ДНК161.6. Эволюционная значимость мтДНК181.7. Гаплогруппы мтДНК201.8. Этиология заболеваний энергообмена221.9. Первичные митохондриальные заболевания231.9.1. Митохондриальные энцефаломиопатии261.9.2. Вторичные митохондриальные заболевания271.9.3. Гипоксия в патогенезе митохондриальных заболеваний281.10.

Существующий диагностический комплекс281.10.1. Морфологические критерии291.10.2. Молекулярно-генетические критерии301.11. Функциональная оценка митохондриальных нарушений30ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ332.1. Секвенирование митохондриальной ДНК332.1.1 Дизайн праймеров332.1.2. Сбор биоматериала и выделение ДНК332.1.3. Амплификация ДНК-фрагментов и оценка их качества342.1.4. Реакция секвенирования362.1.5. Разделение продуктов секвенирования с помощью капиллярногоэлектрофореза3732.1.6. Анализ результатов секвенирования372.1.6.1. Первичная обработка данных372.1.6.2.

Аннотация генетических вариантов мтДНК382.1.6.3 Ресурсы, использованные для анализа неклассифицированныхвариантов392.1.6.4. In silico инструменты для предсказания структуры белка402.2. Анализ экспрессии митохондриальных генов422.2.1. Разработка панели422.2.2. Сбор биоматериала и выделение РНК.432.2.3. Пробоподготовка и работа с анализатором nCounter432.2.4.

Первичная обработка данных442.2.5. Глубокий анализ генных сетей452.2.6. Статистическая обработка материала452.3. Патоморфологическое исследование мышечных биоптатов462.4. Клиническое обследование пациентов и негенетические лабораторныепоказатели47ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ493.1. Анализ особенностей митохондриальной ДНК493.1.1 Базовые характеристики мтДНК пациентов в исследуемой выборке 493.1.2.

Результаты поиска подтвержденных мутаций мтДНК543.1.3. Частые варианты в исследованной выборке пациентов553.1.3.1. Взаимосвязь вариантов A10732T и C12562G с клиническойкартиной пациентов583.1.4. Аннотация вариантов и расчет индекса патогенности623.1.5. Зависимость клинической картины от гаплогруппы пациента723.1.5.1. Гаплогруппа HHV743.1.5.2. Гаплогруппа Т773.1.5.3.

Гаплогруппа U783.1.5.4. Гаплогруппа J7943.1.5.5. Обсуждение взаимосвязи элементов клинической картины сгаплогруппой пациентов803.2. Анализ экспрессии митохондриальных генных сетей823.2.1. Оценка качества анализа экспрессии генов833.2.2. Построение тепловой карты экспрессии генов883.2.3. Визуализация данных с помощью диаграмм рассеяния933.2.4. Статистический анализ экспрессии генов983.2.5. Глубокий анализ генных сетей1113.2.5.1. Вовлеченность в процессы митохондриальнойжизнедеятельности1113.2.5.2. Вовлеченность в метаболические процессы1183.2.5.3. Вовлеченность в передачу сигнала1223.2.5.4. Поиск общих регуляторов1293.2.5.5.

Вовлеченность в патологические процессы1333.2.6. Корреляции с особенностями митохондриальной ДНК1403.2.7. Корреляции с ультраструктурными нарушениями мышечной ткани1433.2.8. Корреляции с клинической картиной146ЗАКЛЮЧЕНИЕ149ВЫВОДЫ151ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ153СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ154ПРИЛОЖЕНИЕ165СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ1665ВВЕДЕНИЕАктуальность проблемы и степень разработанности темыСобирательный термин «митохондриальные заболевания» означаетклиническигетерогеннуюгруппунарушений,вызванныхдефектамидыхательной цепи митохондрий и ассоциированных с мутациями вмитохондриальных генах. Согласно данным на 2017 год, распространенностьмитохондриальных заболеваний составляет один случай на 5000 человекнаселения, причем точечные мутации составляют ~ 50% всех патогенныхмутаций митохонондриальной ДНК (мтДНК) [1].

Один из 500 новорожденныхявляется бессимптомным носителем патогенных мутаций мтДНК, а каждыйчетвертый новорожденный несет вариант мтДНК неизвестной клиническойзначимости [2]. Каждый из таких вариантов может являться определяющимфактором при развитии заболевания.Рассматривая митохондриальные заболевания в целом, можно сказать,что это хронический недостаток клеточной энергии. В зависимости от степенинарушениямитохондриальногоаппарата,симптомымогутвключатьмышечную слабость, болевые синдромы, трудности глотания и желудочнокишечныерасстройства,болезнисердца,печени,сахарныйдиабет,респираторные осложнения, судороги, проблемы со зрением и слухом, ацидоз,задержку развития, восприимчивость к инфекциям [1]. В частности, кболезням, вызываемым мутациями митохондриальных генов, относятсянаследственная атрофия зрительных нервов Лебера, синдром NARP, синдромMERRF, синдром MELAS, синдром Кернса-Сейра, синдром Пирсона [3].Диагностика митохондриальной дисфункции вызывает значительныезатруднения в связи с многообразием проявлений митохондриальныхнарушений, мозаичности их распределения в тканях организма и сложностиих методического выявления.

Большинство митохондриальных заболеванийнеявляютсясиндромальныминеспецифическимисимптомами.иобладаютНаиболееперекрывающимисяраспространеннойформойявляются митохондриальные энцефаломиопатии. Данные литературы о6взаимосвязи вариантов мтДНК с клинической картиной митохондриальныхэнцефаломиопатий противоречивы. Также на данный момент не существуетобщепринятого биоинформатического алгоритма, позволяющего оценитьвлияниеиндивидуальныхособенностеймтДНКнафенотипическиехарактеристики.Кроме непосредственного влияния мутаций в мтДНК на структуру ифункции комплексов респираторной цепи митохондрий, они также могутслужитьэпигенетическимифакторами,определяющимиуровеньтранскрипционной и трансляционной активности клетки, её жизненный цикли взаимодействие с окружением [4].

Фундаментальные представления означимости вариаций мтДНК для фенотипа на клеточном, тканевом иорганизменномуровняхсильноограничены,аисследованиячастопротиворечивы в своих выводах.Такимобразом,анализсовременногосостоянияобластимитохондриальных болезней в целом, и энцефаломиопатий в частности, атакже их генетических детерминант, показывает актуальность углубленногоизучения индивидуальных изменений мтДНК при этих нарушениях исоздания алгоритма для оценки их диагностической значимости.Цель исследованияОпределение диагностически значимых изменений митохондриальнойДНКпринаследственныхзаболеваниях,проявляющихсявформеэнцефаломиопатий.Задачи исследования1. Выявить основные варианты изменений митохондриальной ДНК приклинически выраженных энцефаломиопатиях и разработать подходы ких систематизации.2. Оптимизировать биоинформатический алгоритм оценки изменениймитохондриальной ДНК, имеющих клиническую значимость.73.

ВыявитьвзаимосвязьособенностеймитохондриальнойДНКиклинической картины пациентов с энцефаломиопатиями.4. Провести оценку функциональных изменений митохондриальногоаппарата на основе анализа экспрессии митохондриальных генных сетейпри первичных и вторичных митохондриальных нарушениях.5. Выявить взаимосвязь функциональных изменений митохондриальногоаппарата с особенностями митохондриальной ДНК и клиническойкартиной пациентов с энцефаломиопатиями.Научная новизна исследованияВыявлены основные варианты изменений митохондриальной ДНК приклиническивыраженныхэнцефаломиопатиях,описанораспределениегаплогрупповых полиморфизмов и диагностически значимых вариантов.Впервые описаны две частых мутации A10732T (21% пациентов) иC12562G (26% пациентов), доказана их взаимосвязь с митохондриальнымиэнцефаломиопатиями в целом, а также с отдельными клиническимисимптомами.Разработан показатель «индекс патогенности митохондриальной ДНК»,представляющего собой комплексную биоинформатическую характеристикувариантов мтДНК пациента и доказана эффективность его оценки.Впервые описаны корреляции гаплогрупповых характеристик сэлементами клинической картины энцефаломиопатий.

Также показаназначимость оценки гаплогрупповой принадлежности пациента.Впервыепроведенамитохондриальногофункциональнаяаппаратаспомощьюоценкасостоянияанализаэкспрессиимитохондриальных генных сетей при энцефаломиопатиях. Проведеносравнение паттернов экспрессии с нервно-мышечными заболеванияминемитохондриальногогенезадифференциальной диагностики.ивыявленыосновныекритериидля8Установленазависимостьмеждуфункциональнымсостояниеммитохондриального аппарата, характеристиками мтДНК и клиническойкартиной пациентов с митохондриальными энцефаломиопатиями.Теоретическая и практическая значимость исследованияРазработандиагностическийнабордлясеквенированиямитохондриальной ДНК, который позволяет выявлять максимальное числоиндивидуальныхгенетическихизмененийпримитохондриальныхэнцефаломиопатиях.Показана эффективность биоинформатического алгоритма анализамтДНК, учитывающего персональные характеристики пациента, а такжеразработан показатель «индекс патогенности митохондриальной ДНК».