Диссертация (Диагностическое значение определения особенностей митохондриальной ДНК при энцефаломиопатиях у детей), страница 8

В каждом образце помимо матричных РНК, гибридизованных сметками, содержалось также 5 положительных и 5 отрицательныхвнутреннихконтролей,стандартныхдлялюбыхпанелейданногопроизводителя. Положительные контроли представляют собой сериюразведений РНК-образца, анализируя линейность их значений, программаоценивает качество реакции гибридизации. Отрицательные контроли несодержат нуклеиновых кислот и служат для учета фоновой флуоресценции.Медианные значения отрицательных контролей служили пороговымуровнем для детекции экспрессирующихся генов.45Также программа оценивает качество детекции меток цифровыманализатором: процентное содержание меток в каждом поле видимости иравномерность их распределения.

Образцы, для которых нормальныезначения этих показателей не соблюдались, помечались программой.Для нормализации были использованы значения экспрессии 6 геновдомашнего хозяйства, а также разведения положительного контроля. Упроизводителясуществуетрекомендацииотносительнозначенийкоэффициентов нормализации: от 0,3 до 3.2.2.5. Глубокий анализ генных сетейСпомощьюмодуляAdvancedAnalysisпрограммыnSolverпроизводилась статистическая оценка различий в экспрессии генов в разныхэкспериментальных группах. Различия считались достоверными при р<0,05.Эти различия были визуализированы в виде тепловых карт, диаграммрассеяния и вулканообразных диаграмм дифференциальной экспрессии. Дляанализа генов с различающейся активностью производился поиск генныхсетей и/или внутриклеточных каскадных реакций, с которыми ониассоциированысогласноданнымлитературы.Результатыпоискавизуализировались с помощью встроенных инструментов в виде схем.

Дляоценки меры схожести (различия) генных кластеров с известными группамигенов использовался коэффициент Жаккара.2.2.6. Статистическая обработка материалаСтатистический анализ данных проводили в программе SPSS версии 22(IBM,США).Дляоценкинулевойгипотезывраспределениифенотипического признака с фиксированными значениями использоваликритерий хи-квадрат.Различиявпроявленииколичественногофенотипическогоилигенотипического признака оценивали с помощью непараметрическихкритериев Манна-Уитни и Колмогорова-Смирнова. Связь между двумя46количественными признаками оценивали с помощью критерия корреляцииПирсона и ранговой корреляции Спирмена.Для анализа взаимосвязи уровня экспрессии генов с количественнымифенотипическими признаками были использованы критерий корреляцииПирсона и ранговой корреляции Спирмена.

Для анализа взаимосвязи уровняэкспрессиигеновскачественнымифенотипическимипризнакамииспользовали критерии Манна-Уитни и Колмогорова-Смирнова, считаядостоверными различия при р<0,05.Для оценки достоверности различия распределения фенотипическогопризнака с фиксированными значениями среди пациентов с различнымигруппами генотипов использовали критерий хи-квадрат, а также хи-квадратв точном решении Фишера.2.3. Патоморфологическое исследование мышечных биоптатовМышечные биоптаты также были исследованы гистологически напредмет маркеров митохондриальной патологии.Заморозка биопсийного материала осуществлялась в жидком азоте.

Насрезах ткани толщиной 10 и 20 мкм, полученных с использованиеммикротома-криостата Microm HM 505 N, было проведено гистохимическоевыявление активности сукцинатдегидрогеназы (СДГ) методом с нитросинимтетразолием по Нахласу. Оценка выраженности гистоферментохимическихизменений активности митохондрий в мышечных волокнах I типа (количестваи выраженности RRF, «рваных красных волокон») проводилась по балльнойсистеме:1 балл RRF – умеренные субсарколеммальные скопления метки;2баллаRRF–умеренныесубсарколеммальныеиумеренныеиумеренныемежмиофибриллярные скопления метки;3баллаRRF–грубыесубсарколеммальныемежмиофибриллярные скопления метки;4 балла RRF – грубые субсарколеммальные и грубые межмиофибриллярныескопления метки.47Рассчитанинтегральныйколичественныйпоказательмитохондриальной дисфункции – «митохондриальный индекс» (Таблица 2.1.),представляющийсобойсуммубалловвыявленныхморфологическихпараметров, разделенную на количество этих параметров.Таблица2.1.Морфологическиекритерииопределениямитохондриального индекса.Митохондриальный индекс БаллыRRF слабые2RRF значительные5Слабое снижение СДГ3Сильное снижение СДГ5Слабое снижение СОХ3Сильное снижение СОХ5RRF 5-10%2RRF 10-30%3RRF 30-50%4RRF более 50%52.4.

Клиническое обследование пациентов и негенетическиелабораторные показателиОпределениеактивностилактатдегидрогеназы(ЛДГ),аланинаминотрансферазы (АЛТ) и аспартатаминотрансферазы (АСТ) (Ед/л) всыворотке крови больных было проведено модифицированным методомсогласно рекомендациям Скандинавского комитета по ферментам (SCE) сиспользованием реагентов фирмы «HUMAN» (Германия) на анализаторе«KONELAB 20» (Финляндия) фирмы THERMO Clinical Labsystems.Определениеактивностикреатинфосфокиназы(КФК)(Ед/л)всыворотке крови пациента проводилось модифицированным стандартнымметодом согласно рекомендациям Европейского Комитета по Стандартам в48Клинической Лаборатории (ECCLS) и Международной Федерации поКлинической Химии (IFCC) с использованием реагентов фирмы «HUMAN»(Германия) на анализаторе «KONELAB 20» (Финляндия) фирмы THERMOClinical Labsystems.Референсные интервалы для вышеописанных показателей приведены втаблице 2.2.Таблица 2.2.

Референсные значения некоторых показателей прибиохимическом исследовании крови.Показатель Ед. изм.Референсный интервалАСТМЕ/л0–40АЛТМЕ/л0–45ЛДГЕд/л0–450КФКЕд/л15 –19049ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ3.1. Анализ особенностей митохондриальной ДНКВ ходе выполнения исследования было проведено секвенированиемитохондриальнойДНК58пациентов,направленныхотделениямиклинической генетики, психоневрологии и эпилептологии №2, а такжекардиологии и аритмологии Научно-Исследовательского КлиническогоИнститута Педиатрии имени академика Ю.Е.

Вельтищева РНИМУ им. Н.И.Пирогова как пациентов с клиническими признаками митохондриальныхэнцефаломиопатий. Пятьдесят четыре пациента не являются родственниками,однако в выборке присутствует две пары сибсов мужского пола. Такжепроведено секвенирование 10 неродственных контрольных образцов людей,не имеющих признаков каких-либо патологических процессов, в т.ч.

имитохондриального характера, на момент исследования.В выборку пациентов вошли 32 пациента женского и 26 мужского пола.В контрольную выборку вошли 5 пациентов женского и 5 мужского пола.Статистический анализ частот встречаемости переменной достоверныхразличий в распределении пола внутри каждой из выборок не выявил. Возрастпациентов составлял от 1 года до 18 лет, возраст здоровых людей – от 25 до 65лет. Средний возраст людей из контрольной группы целенаправленно выбранвболеевысокомдиапазонедлявозможностиидентифицироватьмитохондриальные генетические варианты накопительного характера.3.1.1 Базовые характеристики мтДНК пациентов в исследуемой выборкеПолученные последовательности мтДНК пациентов сравнивались среференсной последовательностью rCRS.

Число отклонений от референса вгруппе пациентов колебалось от 12 до 43 вариантов, в контрольной группе –от 16 до 32. Столь существенная разница в количестве найденных вариантов уразных пациентов объяснима. Референсная последовательность rCRSпредставляет собой результат секвенирования мтДНК одного человекаевропеоидной расы, которое было произведено в 1981 году в Кембриджском50университете под руководством Ф.

Сэнгера [81]. Референсный геномотносится к гаплогруппе H2a2a1 [82]. Очевидно, что при исследованиииндивидуумов, которые принадлежат к той же, либо близкой гаплогруппе,число отличий от референса будет меньшим, чем при исследовании пациентовсинымигаплогруппами.Длякаждогопациентабылаопределенагаплогрупповая принадлежность (табл. 3.1) до второго знака. Наиболеераспространенными являются группы HHV (22 человека среди пациентов и 4здоровых), U (10 пациентов и 2 здоровых), JT (10 пациентов и 2 здоровых).Эти группы относятся к наиболее распространенным в Европе.

В связи с тем,что гаплогруппа JT считается исчезнувшей, в дальнейшем результаты будутпредставлены отдельно для гаплотипов J и Т, происходящих из этой линиинаследования. Достоверных различий по частотам встречаемости гаплогруппв исследуемых выборках не выявлено.Анализируя процесс определения гаплогрупповой принадлежностипациентов, следует отметить, что определение субклада до второго знака (тоесть, в среднем, по 15-17 точечным заменам) является оптимальным сдиагностической точки зрения.

Это позволяет с достаточной точностьюидентифицировать пациента, определять родственные связи и даже проводитьконтроль контаминации образцов. Более глубокое определение субклада вомногих случаях невозможно в связи с высокой частотой обратных мутаций ворганелле.Таблица 3.1. Гаплогрупповая принадлежность мтДНК пациентов иконтрольной группы.51Шифр пациентаГаплогруппа34W1Группа пациентов с мтЭМП35J1b1U5b36U5a2J1c37J1c3C5a38I14U5a39H5U5a40T2b6H1c41R2b7J2a43U2e8U5b44H2410J1c46D4o11X2b47H1a12T2a48R013T2a49H1c14H1b50N9a16H8451V1a17D4j52V2a18K1c53HV20H2a54H1m21H5a55HV0a22H11a59T2b23H11a61T1a24H10162HV0a25H1a64U2b26H1b65I227G2a68I1a28H172H28a29H1c73H28a30U4d75U4a31U5a32C4bКонтрольная группаК1U5b52К2K1cК3HК4H6aК5U5aК6HV8К7H5aК8T1aК10T1bК12R53Как правило, у человека выявляется несколько гаплогрупповых мотивов(наборов генетических вариантов), а определение принадлежности происходит подоминирующему [83].

Однако мотивы, представленные в меньшей степени,классифицируются как непатогенные полиморфизмы. Оставшиеся после этогоотбора генетические варианты рассматривались как потенциальные патогенныекандидаты.Кроме гаплогрупповых полиморфизмов из рассмотрения были исключеныкрайне полиморфные варианты, ранее описанные в контрольном регионе впозициях 303-315, 522-523, 574, 16180-16193 и 16519 [84].Среднее число отклонений от референсной последовательности средипациентов было на 5,62 единиц выше, чем в контрольной группе (здесь и до концараздела таблица 3.2).

При этом гаплогрупповых полиморфизмов у пациентоввыявлялосьдостоверноменьше,авариантов-кандидатов,соответственно,достоверно больше. Всего в выборке пациентов было обнаружено 115генетических вариантов: в среднем, у каждого пациента выявлялось 1,97вариантов, подлежащих дальнейшей аннотации. В контрольной группе из 10человек только у троих было обнаружено варианты-кандидаты, среднее значениеих детекции составило 0,40 единиц.Таким образом, уже на этапе оценки базовых характеристик мтДНК,учитывая, что гаплогруппы были распределены в обеих выборках пациентовравномерно, нами были получены косвенные свидетельства о более высокомуровне мутационной активности в митохондриях пациентов с митохондриальнымиэнцефаломиопатиями.Далее среди выявленных вариантов-кандидатов производился поискподтвержденных, достоверно ассоциированных с заболеваниями мутаций, аостальныевариантыподвергалисьаннотационномубиоинформатическомуанализу, то есть проводилась оценка их патогенетического потенциалаотносительно рассматриваемой нозологической формы.54Таблица 3.2.

Статистические параметры для некоторых характеристикмтДНК пациентов и здоровых пациентов.Группа:Параметр0пациенты, 1Среднее–контрольЧисло122,50Станд.р,р,ошибкаМанна-Колмогорова-среднегоУитниСмирнова0,0640,0840,1990,1300,0010,0200,0000,0150,0010,0201,881отклонений отреференсаЧисло028,121,260122,101,853гаплогрупповыхвариантовПроцентноесодержаниегаплогрупповыхвариантовЧисло вариантовкандидатовПроцентноесодержаниевариантовкандидатов026,161,250198,19200,78654092,46710,8504210,400,16301,970,20411,80900,7867307,53290,850423.1.2. Результаты поиска подтвержденных мутаций мтДНКМутаций, являющихся достоверно патогенными согласно базе данныхMITOMAP (всего к январю 2018 г.