Диссертация (Диагностическое значение определения особенностей митохондриальной ДНК при энцефаломиопатиях у детей), страница 7

Изменения, которые соответствовалихотя бы одной из следующих характеристик:a. новый вариант;b. редкий вариант, обозначенный в литературе или ресурсеMITOMAP как «полиморфизм», но его нет в базе HumanMitochondrial Database или его аллельная частота ≤ 0,2%;c. редкий вариант, который обозначен как «мутация» на основанииисследования единичной семьи или единичной статьи, при этомфункциональные исследования его патогенности отсутствуют.39Варианты, попавшие в эту группу, рекомендуется дополнительнооценить с помощью:a.

in silico инструментов по предсказанию структуры белка и оценкипотенциальной патогенности миссенс вариантов, а также дляоценки эволюционной консервативности локуса;b. базы данных Mamit-tRNA, в случае если вариант локализован водном из генов тРНК;c. оценки гетероплазмии в крови и моче по материнской линии.3.Патогенный вариант.

Обозначен как «подтвержденная мутация» наресурсе MITOMAP; описан в нескольких клинических исследованияхнеродственных пациентов или семей; существуют функциональныеисследования его влияния на организм модельного животного.2.1.6.3 Ресурсы, использованные для анализа неклассифицированныхвариантовДляанализавыявленныхвариантовнеизвестнойзначимостииспользовались международные базы данных: PhyloTree, MITOMAP, TheHuman Mitochondrial Genome Database, The Mamit-tRNA database, OMIM.PhyloTree[32]содержитнаиболееполнуюинформациюомитохондриальном филогенетическом древе человека.

Частота встречаемостивариантов в разных гаплогруппах неодинакова. Если редкие варианты обычновстречаются в определенной гаплогруппе, то низкие аллельные частоты могутбыть связаны с недостаточной этнической представленностью в базе данных.Зачастуюугаплогрупповыходногочеловекамотивов.можетГаплогруппуобнаруживатьсяпринятонесколькоопределятьподоминирующему мотиву, при этом варианты, ассоциированные с другимигаплогруппами, считаются непатогенными.MITOMAP [71] содержит данные как публичных, так и коммерческихресурсов; является основным источником информации по митохондриальнымвариантам.

Все варианты в нём разделены на две категории: полиморфизмы имутации. К полиморфизмам относятся непатогенные, соматические и40неопубликованные варианты. К мутациям относятся подтвержденныепатогенные или ассоциированные с каким-либо заболеванием варианты.Оценка консервативности локуса производится также с помощьюсервиса MITOMAP. Оценивается в случае, если вариант находится вкодирующей части митохондриального генома.

Представляет собой процентвидов, у которых есть исследуемый аллель. Проводилось сравнение соследующими видами: Homo sapiens, Bos tarurus, Mus musculus/Rattusnorvegicus, Gallus gallus, Xenopus laevis, Danio rerio, Drosophila melanogaster,Strongylocentrotus droebachiensis, Caenorhabditis elegans, and Saccharomycescerevisiae.Human Mitochondrial Database (hmtDB) [72] содержит около 30000митохондриальныхгеномовиявляетсяважныминструментомдляопределения частоты встречаемости вариантов. Для определения вариантамтДНК как редкого используется пороговая аллельная частота ≤0,2%. Следуетотметить, что представленность разных этнических групп (и соответственногаплогрупп) на данном ресурсе сильно разнится.

Некоторые варианты могутоказаться редкими только в связи с недостаточной представленностьюроссийской популяции.The Mamit-tRNA database [73] содержит информацию о тРНКмлекопитающих и используется для оценки значения варианта в генах тРНКмитохондрий.OMIM [42] – сравнительная, постоянно пополняемая база человеческихгенов и клинических фенотипов. Кроме полной информации обо всехизвестных менделевских заболеваниях, содержит данные обо всех основныхмитохондриальных генах и их нарушениях.2.1.6.4. In silico инструменты для предсказания структуры белкаДля дополнительного in silico анализа вариантов с неизвестнойзначимостью использовали программное обеспечение Sift, Polyphen, Provean,I-Mutant, PhD-SNP, Panther.

PolyPhen, I-Mutant и Provean используютструктурные и функциональные характеристики белка, в то время как Sift,41Panther and PhD-SNP апеллируют к эволюционным перестройкам белка итаким образом определяют, допустимо ли рассматриваемое отклонение длянормального функционирования протеина.PolyPhen 2.0[74]–программа,длясозданиякоторойиспользовалась база данных HumVar. Оценивает вариант от 0 (не патогенный)до 1 (патогенный).Provean [75] – in silico инструмент для предсказания потенциальнойвредоносности аминокислотной замены.

Оценка производится на основаниипорогового значения: оценки менее -2,5 свидетельствуют в пользупатогенности варианта.Sift[76] – in silico инструмент для предсказания потенциальнойвредоносности аминокислотной замены. Оценивает вероятность измененияфункции белка при аминокислотной замене. Достоверной считает оценку(вероятность) <0,05.I-Mutant 2.0 [77] – машина опорных векторов, которая рассчитываетизменение свободной энергии Гиббса.

Если это изменение положительно,программа оценивает миссенс-вариант как увеличивающий стабильностьбелка, в обратном случае – как дестабилизирующий фактор.PhD-SNP [78] – также машина опорных векторов, веб-сервис, которыйвысчитывает показатель безопасности замены. Если этот показатель >0,5,программа считает замену ассоциированной с заболеванием; если жепоказатель ≤0,5, замена считается нейтральной.Panther [79] – веб-инструмент, работа которого основана на скрытойМарковской модели. Она сравнивает последовательность белка с семействомэволюционно родственных белков, на основе чего вычисляет уровеньэволюционной консервативности локуса.

Если этот уровень в численномвыражении ≤ -3, замена считается патогенной.422.2. Анализ экспрессии митохондриальных геновДля анализа уровня экспрессии нескольких митохондриальных генныхсетей была использована технология nCounter от Nanostring Technologies(США). Она основана на классическом методе молекулярной биологии –фотофиксации флуоресцентных меток на специфических молекулах. Вданном случае метки имеют особое строение, а именно: захватывающуютаргетнуюмолекулуирепортерную(т.е.,непосредственнофлуоресцирующую) части. Каждый зонд (репортерный и захватывающий)имеет 50 нуклеотидную комплементарность к последовательности РНКисследуемого гена. Данный метод оценки экспрессии генов впервые былописана в 2008 году [80].

Разрешение метода достигает 1 молекулы РНК.2.2.1. Разработка панелиДля данного исследования была составлена пользовательская панель,содержащая12генныхсетей,ассоциированныхсработоймитохондриального аппарата. Всего в панель входило 207 анализируемыхгенов, а также 6 генов домашнего хозяйства, уровень экспрессии которыхбыл впоследствии использован для нормирования данных. Гены для панеливыбраны на основе анализа данных литературы с расчетом на максимальноширокий охват регулирующих и регулируемых в отношении органеллыэлементов. Полный список генов, вошедших в панель, приводится вприложении.Для дизайна зондов использована информация о последовательностикаждого РНК-продукта из базы данных RefSeq. Флуоресцентные метки былиподобраны таким образом, чтобы их специфичность составляла ≥ 99,8%.

Длятрех генов специфичность составила 97%, при этом второй мишенью вкаждом случае являлся псевдоген исследуемого продукта. Опираясь наданные литературы, транскрипционная активность псевдогенов в расчет непринималась, а указанные транскрипты анализировались так же, как иостальные.432.2.2. Сбор биоматериала и выделение РНК.Работы по сбору биоматериала проводились на базе отделенияпсихоневрологии и эпилептологии, генетики и НИЛ общей патологии ОСПНИКИ Педиатрии им. акад.

Ю.Е. Вельтищева. Использовался биопсийныйматериал скелетной поперечнополосатой мышечной ткани передней группымышц бедра, взятый с диагностической целью у 48 пациентов с различныминервно-мышечнымизаболеваниями,какмитохондриального,такинемитохондриального генеза. Биоматериал был фиксирован в формалине изатем парафинизирован.РНК выделялась в специализированном помещении, изолированным отлюбых других молекулярно-генетических процессов, в стерильном боксе спомощью набора RNeasy FFPE Kit (Qiagen, США).

От парафинизированногоблока на микротоме отделялось 5-7 срезов толщиной 10 мкм, затемпроводился лизис парафина и ткани, а также очистка тотальной РНК согласноинструкции производителя. Элюцию производили с помощью воды,обработанной DEPC. Концентрацию образцов измеряли флуориметрически спомощьюприбораQubit2.0(ThermoFisherScientific,США)сиспользованием набора Qubit dsRNA HS Assay Kit по инструкциипроизводителя.ВыделенныеобразцыРНКхранилипри-80○Свизолированной секции морозильника.2.2.3. Пробоподготовка и работа с анализатором nCounterДля выделенных образцов РНК производилась реакция гибридизации сфлуоресцентными метками из панели.

Для этого составлялась реакционнаясмесь из 5 мкл образца РНК (содержащих в себе 100 нг нуклеиновойкислоты), 5 мкл репортерных зондов, 5 мкл захватывающих зондов и 15 мклреакционного буфера. За исключением РНК образцов все компоненты смесибыли в составе панели Nanostring (США). Далее использовали термоциклерVerity (Thermo Fisher Scientific, США) и 24-26 часов выдерживалиреакционную смесь на температуре 65○С.44После этого образцы переносились на станцию пробоподготовкиnCounter. С использованием режима “high sensitivity” в течение 3,5 часовобразцы переносились на дно лунок специализированного оптическипрозрачного картриджа с помощью биотин-стрептовидиновой конъюгации изатем очищались от излишков флуоресцентных меток с помощьюмногократной промывки магнитными частицами в буферном растворе.

Всереагенты и расходные материалы содержались в наборе nCounter Master Kit(Nanostring Technologies, США).Затем инактивированные на картридже образцы помещали в цифровойанализаторnCounter,гдевтечение5часовспомощьювысокочувствительного флуоресцентного микроскопа на максимальномрежиме фиксировалось 555 изображений видимого поля на дне лунки.Анализаторавтоматическипереводилцифровыеизображениядетектированных флуоресцентных зондов в цифровую форму и генерировалтекстовый файл, содержащий количественное значение экспрессии каждогогена панели для каждого образца в отдельности.Всего было произведено 4 запуска станции пробоподготовки и 4 запускацифрового анализатора – по 12 образцов каждый.2.2.4. Первичная обработка данныхПервичный анализ полученных данных осуществлялся с помощьюфирменного программного обеспечения nSolver (Nanostring Technologies,США).