Диссертация (Диагностическое значение определения особенностей митохондриальной ДНК при энцефаломиопатиях у детей), страница 6

На сегодняшний денькак для первичных митохондриальных энцефаломиопатий, так и длявторичных нервно-мышечных заболеваний, не существует комплексногоисследования митохондриального аппарата, которое бы включало как данныесеквенирования, так и функциональную оценку на основе экспрессии генов, атакже сопоставление молекулярно-генетических находок с клиническойкартиной и результатами светомикроскопического патоморфологическогоанализа.33ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ2.1. Секвенирование митохондриальной ДНКСеквенирование митохондриального генома производилось по методуСэнгера. Данный метод был выбран в связи с его возможной длинойпоследовательногосчитываниянуклеотидовдо800пароснований;возможностями чтения продолжительных гомополимерных участков, которыево множестве встречаются в мтДНК; а также во избежание необходимостиверифицировать найденные новые генетические варианты.2.1.1 Дизайн праймеровДля полного покрытия митохондриального генома была разработанапанель из 50 пар праймеров, синтезированных Applied Biosystems (ThermoFisher Scientific, США).

Праймеры проверялись на потенциал образованияпобочных продуктов амплификации, а также на потенциальное наличиеоднонуклеотидных полиморфизмов в местах отжига с помощью ресурсаMitomap. Размер целевых участков составлял в среднем 450 пар оснований.Все ампликоны перекрывались между собой на 47-55 пар оснований, чтопозволило избежать охвата ядерных псевдогенов. Каждый праймер былснабжен5´концевымучастком[TGTAAAACGACGGCCAGT]–последовательностью M13 – для более стабильных результатов на этапепроведения реакции секвенирования.2.1.2.

Сбор биоматериала и выделение ДНКБиоматериалпациентовпредставлялсобойлибоцельнуюпериферическую венозную кровь, либо соскоб буккального эпителия, либосухие капли крови. В первом случае образцы получали путем венепункции ивакуумных полипропиленовых пробирок, содержащих К2-ЭДТА (“Vacutainer”Beckton Dickinson, США). При заборе буккальных соскобов использовалисьзонды-тампоны (Nuova Aptaca, Италия). Сухие пятна крови собирались спомощью пункции из вены или из пальца на бумажный носитель ивысушивались в стерильных условиях при комнатной температуре не менее 2-34х часов.

Сбор осуществлялся на базе отделений клинической генетики,психоневрологии и эпилептологии №2, а также в отделениях кардиологии иаритмологииНаучно-ИсследовательскогоКлиническогоИнститутаПедиатрии имени академика Ю.Е. Вельтищева РНИМУ им. Н.И. Пирогова впериод с 2013 по 2016 гг.Контрольныеобразцыпредставлялисобойвенознуюкровьдобровольцев, не имевших признаков каких-либо патологий, в том числе имитохондриального характера, на момент исследования.

Их биоматериалтакже собирался с помощью вакуумных систем на базе отделенияклинической генетики ОСП НИКИ Педиатрии им. акад. Ю.Е. Вельтищева.Собранные образцы цельной крови хранили при -20○С, а сухие пятна ибуккальные соскобы – при температуре +4-+8 до выделения ДНК. ДНКвыделяли согласно инструкциям производителя наборами QIAamp DNA MiniKit (Qiagen, США) из буккальных соскобов и сухих пятен и QIAamp DNABlood Mini Kit (Qiagen, США) из цельной крови. Элюцию производили спомощью воды, обработанной DEPC (диэтилпилокарбонатом).

Концентрациюобразцов измеряли флуориметрически с помощью прибора Qubit 2.0 (ThermoFisher Scientific, США) с использованием набора Qubit dsDNA HS Assay Kit поинструкции производителя.2.1.3. Амплификация ДНК-фрагментов и оценка их качестваПЦР проводили в изолированном помещении в стерильном ламинаре.Амплификация всех 50 фрагментов для каждого образца проводиласьединовременно в 50 лунках 96-луночного ПЦР-планшета. В каждую лункудобавлялась одна пара праймеров.

Для единичной реакции использовалось: 5мкл готовой смеси реагентов AmpliTaq Gold 360 PCR Master Mix (ThermoFisher Scientific, США), по 1 мкл (5 пмоль) прямого и обратного праймера, 0,4мкл воды, обработанной DEPC, 1,4 мкл 50% глицерина, 1 мкл геномной ДНК;общий объем реакционной смеси составлял 10 мкл.35ПЦР проводили на программируемом ДНК-амплификаторе с золотымблоком GeneAmp 9700 (Thermo Fisher Scientific, США) в 96-луночныхпланшетах.Программа амплификации:1.

Активация Taq-полимеразы 96○С – 5 мин2. 40 циклов:94○С – 30 с60○С – 45 с72○С – 45 с3. Финальная элонгация 72○С 10 минДля удаления побочных продуктов реакции и непрореагировавшихпраймеров реакционную смесь после завершения ПЦР обрабатывалиреагентом ExoSAP-IT (Thermo Fisher Scientific, США). В каждую лункувносили по 2 мкл реагента, затем помещали в ДНК-амплификатор на 45 минутпри 37○С, затем инактивировали фермент при 80○С в течение 15 минут.После очистки измеряли концентрацию ампликонов в каждой реакции спомощью капельного наноспектрофотометра Implen P330 (Implen, Германия).Для дальнейших операций концентрацию снижали до 10 нг/мкл, разбавляяводой, обработанной DEPC.Для оценки качества ампликонов использовали электрофорез вагарозном геле в 1хТАЕ буфере (40 мМ Трис-ацетат, 22мМ ЭДТА, рН 7,5).Концентрация агарозы составляла 2%, бромистого этидия 0,5 мкг/мл.

Переднанесением образов на гель (по 4 мкл каждого) их смешивали с 1 мклбромфенолового синего. Для оценки длины фрагментов на гель такженаносили маркер длины фрагментов DNA Ladder (Invitrogen, США).Электрофоретическое разделение проводили в камере SE-1 (Хеликон, Россия),напряженность поля составляла 60В (источник напряжения Эльф-4, ДНКтехнология, Россия).

Визуализацию фрагментов проводили при 320 нмультрафиолетовом свете на трансиллюминаторе Vilber Lourmat ECX-F15.M36(Vilber Lourmat Deutchland GmbH, Германия). Планшеты с ампликонамихранили при -20○С до следующего этапа.2.1.4. Реакция секвенированияРеакция секвенирования проводилась единовременно для всех 50фрагментов мтДНК. В каждую реакцию вносили 2 мкл (10 пмоль) ПЦРпродукта, 1 мкл праймера М13, 5 мкл смеси BigDye Terminator v.3.1 CycleSequencing Kit (Thermo Fisher Scientific, США), 1 мкл DEPC-обработаннойводы, общий объем реакционной смеси составлял 10 мкл.

BigDye Terminatorv.3.1 Cycle Sequencing реагент предварительно смешивали с BigDyeSequencing Buffer (Thermo Fisher Scientific, США) в соотношении 1 мклреагента к 1,5 мкл буфера.Далее образцы помещали в программируемый амплификатор Verity(Thermo Fisher Scientific, США) и использовали следующую программу:1. Денатурация 96○С – 1 мин2. 25 циклов96○С – 10 с50○С – 5 с60○С – 4 минМеченыеДНК-фрагментыочищалиотнизкомолекулярныхкомпонентов сорбционным реагентов BigDye X-Terminator (Thermo FisherScientific, США), составляя смесь согласно инструкции производителя и затемперемешивая её на шейкере при 1900 оборотах в течение 45 минут.Для контроля реакции секвенирования в дополнительную лункукаждого планшета (содержащего в себе 50 фрагментов мтДНК одногоиспытуемого) добавляли плазмиду из набора BigDye Terminator v.3.1 CycleSequencing Kit с известной последовательностью нуклеотидов.

Плазмидапроходила реакцию секвенирования вместе с остальными ампликонами изатем переносилась в секвенатор.372.1.5. Разделение продуктов секвенирования с помощью капиллярногоэлектрофорезаДля автоматической детекции люминесцентных сигналов от меченыхнуклеотидов в исследуемых ампликонах использовали метод капиллярногоэлектрофореза, а именно генетический анализатор ABI 3500 (Thermo FisherScientific, США).

Для работы анализатора была использована версия 3.0программы Data Collection Software (Thermo Fisher Scientific, США) истандартные шаги запуска анализа согласно инструкции производителя.2.1.6. Анализ результатов секвенирования2.1.6.1. Первичная обработка данныхПервичныйанализполученныххроматограммобрабатываливпрограммном обеспечении Sequencing Analysis (Thermo Fisher Scientific,США).

С помощью него определялось качество распознавания нуклеотидов(QC чтения), фоновый уровень флуоресценции, число прочитанныхнуклеотидов в каждом фрагменте.Также в данной программе использовали модуль “post-processinganalysis” для вывода из анализа тех участков ампликонов, которые не отвечалиследующим параметрам: более 5 недетектируемых оснований подряд,соотношение базовой линии и уровня флуоресценции менее 1:20.В результате для каждого исследуемого фрагмента получали вторичныйтекстовый файл (расширение .seq), который картировали на референснуюпоследовательность (rCRS): GenBank NC_012920 gi:251831106.40 в программеSeqScape(ThermoFisherScientific,США).Ампликон,содержащийконтрольную плазмиду, сравнивали с заявленной последовательностьюпроизводителя.

После выравнивания всех фрагментов на референснуюпоследовательность из программы извлекался файл с расширением .fasta,содержащий полную последовательность мтДНК испытуемого.Первичные данные секвенирования признавались достоверными, вслучае если было прочитано более 99% митохондриальной ДНК образца, а38данныеопоследовательностиконтрольнойплазмидысовпадалисзаявленными производителем.Полученный fasta-файл загружали в онлайн-сервис Mitomaster [70]. Спомощью данной программы определялись генетические варианты – отличияот референсной последовательности. Список этих вариантов далее поступална второй этап обработки – аннотацию.2.1.6.2. Аннотация генетических вариантов мтДНКОбщепринятый сегодня алгоритм аннотации мтДНК основан нарекомендации 2012 г. исследовательской группы Американского колледжагенетики и геномики [60].

Использование стандартных рекомендаций приисследовании мтДНК (в отличие от работ по ядерному геному) затрудненотипом наследования данного генетического материала, фактом высокоймутационной активности и потенциальными внутриклеточными различиями всодержании мутантных копий мтДНК.Найденный вариант последовательности предлагалось рассматривать врамках трёх возможностей:1.Непатогенный вариант – обозначен на ресурсе MITOMAP как«полиморфизм»; достоверные сведения о его связи с заболеванием впопуляционных или семейных исследованиях отсутствуют; частотавстречаемости варианта ≥ 0,2%.2.Вариант неизвестной значимости.