Диссертация (Диагностическое значение определения особенностей митохондриальной ДНК при энцефаломиопатиях у детей), страница 10

Доля пациентов с нервно-мышечным симптомокомплексом:а) при генотипе C12562G+A10732T; б) при иных генотипах.а)б)Рисунок 3.4. Доля пациентов с нарушениями двигательного развития:а) при генотипе C12562G+A10732T; б) при иных генотипах.62Прианализекомплексногогенотипавсравнениисгенотипами,содержащими единичные варианты, статистически выявляется также более частоедиагностирование нарушения и/или задержки двигательного развития ребенка(рис. 3.4.).

Согласно критерию Хи-квадрат, достоверность этого различиясоставляет 0,032, а согласно точному критерию Фишера – 0,053.Таким образом, выявленные нами новые варианты мтДНК C12562G иA10732Tимеютчеткуюстатистическуювзаимосвязьсисследуемойнозологической формой, однако характер этой взаимосвязи требует дальнейшегоисследования.3.1.4.

Аннотация вариантов и расчет индекса патогенностиСогласноприведенномувразделе2.1.6.2материаловиметодовсовременному алгоритму классификации, все выявленные варианты относятся кгруппе неизвестной клинической значимости. Большинство вариантов являютсяновыми или редкими. Только 12 вариантов (10,4%) имели более широкуюраспространенность (составляют более 0,2% геномов в базах метаданных), однакоуказаний на их непатогенную природу на ресурсе Mitomap не обнаружено. В связис этой находкой, мы пришли к необходимости создания собственного алгоритмаоценки подобных вариантов.Для оценки степени патогенности каждого генетического варианта введенинтегративный показатель – индекс патогенности (ИП). Он рассчитывается наоснове 12 параметров:• расположение в геноме (в кодирующей или некодирующей области);• тип варианта (транзиция, трансверсия, делеция/инсерция);• влияние на экспрессию генов (синонимичный, несинонимичный, сдвиграмки считывания, стоп-кодон);• представленность варианта в базах данных;• наличие сведений о патогенности варианта в литературе;• консервативность локуса;63• показания шести использованных программ по предсказанию структурыбелка (Sift, PolyPhen-2, Provean, I-mutant, PhD-SNP, Panther).Значение каждого из параметров для аннотируемого варианта оценивается вбаллах.

Баллы присваиваются согласно следующей логике:1. Встречаемость в популяции, составляющая менее 0,2%, наличие научных работ,в которых вариант расценивается как патогенный, а также соответствующиепредсказания программ считаются показателями патогенности. Все этипоказатели признаются равноценными, наличие каждого оценивается в 1 балл.2. При аллельной частоте более 0,2%, отсутствии научных свидетельств опатогенности варианта и машинной оценке варианта как безвредного, кандидатполучает 0 баллов.3. По параметру расположения в геноме варианты в некодирующей части и в рРНКоцениваются в 0 баллов, в кодирующей части – 1 балл, вариантам же в тРНКприсваивается2балла.ВариантывтРНКимеютболеевысокийпатогенетический потенциал, поскольку затрагивают весь процесс биосинтезамитохондриальных белков.

Кроме того, согласно базе данных MITOMAP,количество подтвержденных патогенных мутаций в генах тРНК составляет 41(на январь 2018 г.), а в кодирующем – 40. Учитывая, что гены тРНК составляютоколо 10% общего размера митохондриального генома, это свидетельствует оболее высокой вероятности патогенности мутаций именно в этих генах. Внекодирующем же регионе мтДНК подтвержденные мутации на данный моментне известны. Этот регион высокополиморфен и обладает низкой эволюционнойконсервативностью, в связи с чем мутации в нем скорее всего не являютсяпатогенными.4.

По типу замены транзиции присваивается 0 баллов, трансверсии – 1 балл.Транзиция – тип мутации, при котором происходит замена пиримидина надругой пиримидин или пурина на другой пурин. При трансверсии,соответственно, пурин заменяется на пиримидин и наоборот. Таким образом,трансверсия обладает большим влиянием на структуру двойной спирали ДНК.645. По влиянию на экспрессию генов синонимичные варианты получают 0 баллов,несинонимичные – 1 балл, делеции/инсерции без сдвига рамки считывания – 1балл. Варианты, приводящие к образованию стоп-кодона или к сдвигу рамкисчитывания, считаются патогенными и оцениваются в 15 баллов (максимальноечисло баллов).6.

По степени консервативности позициям с оценкой более 95% присваивается 2балла, с 80-94,99% – 1 балл, а менее 80% – 0 баллов.Всеперечисленныепатогенности.показателиМаксимальнаясуммируютсявеличинаиндексадлярасчетасоставляет15индексабаллов.Интерпретация индекса проводится с помощью квартилей. Алгоритм расчетапредставлен в таблице 3.5: варианты, получившие от 0 до 7 баллов, считаютсянепатогенными или вероятно непатогенными. Следует подчеркнуть, что даннаяинтерпретация рассчитана на теоретической основе данных литературы имашинных алгоритмов, не является окончательной и требует подтверждениядругими методами исследования.Таблица 3.5. Расчет потенциальной патогенности неклассифицированныхвариантов мтДНК на основе индекса патогенности.Количество баллов (1-15)КвартилиИнтерпретация0–30 – 25%непатогенный4-7>25 – 50%вероятно непатогенный8 - 11>50 – 75%вероятно патогенный12 - 15>75 – 100%патогенныйНаиболее распространенные величины ИП среди пациентов – 12 (n=10) и 15(n=17) баллов (табл.3.6), которые означают патогенность вариантов.

У здоровыхлюдей был выявлен один непатогенный, один вероятно непатогенный и одинвероятно патогенный вариант.65Таблица 3.6. Частоты выявленных значений индекса патогенности в группахпациентов и здоровых.ИП, баллыПациентыЗдоровые077151220320420510601760840102011011210015170Описанный выше индекс патогенности получил название максимального.Это соответствует общим закономерностям алгоритмов оценки вариантов снеизвестной клинической значимостью ядерного генома. Однако, учитываяприведенные несколько ранее данные о достоверно большем количествевыявляемых вариантов-кандидатов среди пациентов по сравнению со здоровыми,введено также понятие общего индекса патогенности. Этот показательсоставляетсясуммированиемвсехрассчитанныхиндексоввариантов-кандидатов человека вне зависимости от их величины.патогенности66Достоверность различия средней величины общего индекса патогенности упациентов и здорового контроля р=0,002, достоверность различия среднейвеличины максимального индекса патогенности у пациентов и здорового контроляр=0,001.

Однако ввиду малого размеры группы здоровых, достоверность различия,рассчитанная при помощи дисперсионного анализа, может быть определенанекорректно. В связи с этим определена достоверность различия распределений повеличине ИП при помощи непараметрических критериев Манна-Уитни иКолмогорова-Смирнова. Для критерия Манна-Уитни достоверность различия дляобоих индексов p<0,001, для критерия Колмогорова-Смирнова достоверностьразличия для обоих индексов р=0,005 (табл. 3.7 и рис 3.5).Таблица 3.7.

Статистические параметры индексов патогенности для группыпациентов и здоровых.ПараметрГруппа:Среднее0 - пациенты,1 –контрольИПмаксимальныйИП общийСтанд.р,р,ошибкаМанна-Колмогорова-среднегоУитниСмирнова08,570,7511,81,18012,811,4211,81,180,00190,0380,0010,00567а)б)Рисунок 3.6. Оценка в баллах: а) максимального и б) общего индексапатогенности для группы пациентов и группы здоровых людей.* - p<0,005 согласно критериям Манна-Уитни и Колмогорова-Смирнова.68Обсуждение значимости расчета индекса патогенностиТаким образом, оба варианта ИП могут быть применены для оценкипатологических изменений митохондриальной ДНК. Однако на наш взгляд, общийИП более полно описывает состояние генетического аппарата митохондрий. Какбыло упомянуто в главе «Обзор литературы», некоторые исследователи считают,что многие митохондриальные заболевания могут быть вызваны комплекснымпоражением мтДНК в результате нарушения системы инактивации реактивныхформ кислорода [91].

Генерация АФК происходит на внутренней мембранеорганеллы,нанейжечастичнозакрепленшапероннымибелкамимитохондриальный нуклеоид [53]. В результате, неустойчивая к токсическомувоздействию пероксидов молекула ДНК находится в постоянном процессемутагенеза.

Митохондриальная же ДНК-полимераза, больше похожая своимстроением на бактериального предка эукариотических полимераз, обладает крайненизким репарационным потенциалом [22]. Предполагается, что развитиемитохондрийвнутриклеткинаправлялосьмолекулярнымэволюционнымпроцессом в сторону единственной функции – продукции энергии для роста иразвития клетки. Этим принято объяснять и множественность митохондрий вклетке, и поликопийность мтДНК, и даже энергозависимость некоторыхэлементов, регулирующих транскрипцию ядерных генов, таких как ацетильные иметильные группы, энхансерные и сайленсерные участки [64]. Основываясь наэтой теории, можно предполагать, что ценность стабильности генома митохондриймогла быть постепенно утрачена, и вместо развития механизмов ДНК-репарацииболее востребованы стали гены, регулирующие митоптоз (программируемуюгибель митохондрий) и их элиминацию [21].

Более того, вероятно, ценностьединичной клетки также снижалась с развитием многоклеточных форм жизни.Поэтому при сильном повреждении митохондрий чаще всего происходитинтоксикация клетки и апоптоз [28]. Как и некоторые другие авторы [15], мыпредполагаем, что у людей с заболеваниями митохондриального генезафункционирование этой внутриклеточной логики нарушено. Патология может69затрагивать любое из её звеньев: ферменты антиоксидантной системы, механизмымитоптоза или апоптоза, механизмы пролиферации митохондрий.Полученные нами данные ярко иллюстрируют, что генетические нарушениямитохондриальнойДНКследуетанализироватьнетолькоспомощьюобщепринятых подходов к аннотации ядерных мутаций, но и с точки зрениякомплексной оценки состояния митохондриального генетического аппарата,поскольку это имеет фундаментальное эволюционное основание и прямоедиагностическое применение.Расчет индекса патогенности для C12562G и A10732TВ завершение приводим значения ИП и систему его расчета для вариантовC12562G и A10732T (таблица 3.8).

Первый относится к категории вероятнопатогенных вариантов, а второй – за счет большего количества негативных оценокin silico инструментов и расположения в более консервативном локусе – ккатегории патогенных. Этот результат свидетельствует в пользу вовлеченностиданных замен в патогенез заболевания. В то же время, рассматриваемые вариантытребуют дальнейшего анализа с точки зрения причин их возникновения изакрепления в геноме пациентов с мтЭМП. Мы предполагаем, что эти событиятакже тесно связаны с метаболическими нарушениями в клетках энергозависимыхтканей пациентов.Безусловно, высокая патогенность этих вариантов и их распространенностьв исследуемой выборке накладывает отпечаток на уровень общего индексапатогенности среди пациентов.