Диссертация (Диагностическое значение определения особенностей митохондриальной ДНК при энцефаломиопатиях у детей), страница 9

в базе описано 677 патогенных мутаций [71]),ни в группе пациентов, ни в контрольной группе не выявлено. Такжепроанализированы результаты полноэкзомного секвенирования 41 пациента: в55ядерном геноме мутаций, достоверно ассоциированных с митохондриальнымиЭМП, не выявлено.Это один из важнейших результатов, полученный в ходе выполнения даннойработы. Современные рекомендации различных генетических ассоциаций иобществ базируются на поиске ранее описанных мутаций, либо на максимальнообъективной оценке каждого варианта путем ранжирования выявленныхотклонений от референсной последовательности.

Как показывает исследованнаянами выборка, в реальных условиях работы врача-генетика, и соответственно,лабораторного молекулярного генетика, такие мутации являются в большейстепени исключением среди множества выявляемых вариантов неизвестнойклинической значимости. В связи с этим, задача создания алгоритма аннотациитаких вариантов и выявления их влияния на клиническую картину становитсячрезвычайно актуальной. В мировой практике существует два подхода к решениюэтой проблемы: создание перечней часто встречающихся мутаций у пациентов сопределенной нозологической формой и максимально подробный разностороннийбиоинформатический и статистический анализ выявляемых вариантов каждогопациента.

В данной работе использованы оба этих подхода.3.1.3. Частые варианты в исследованной выборке пациентовВ группе пациентов обнаружено два часто встречающихся варианта:A10732T и C12562G. Первый встречается у 12 пациентов, второй – у 15, причем у10 пациентов эти варианты встречаются одновременно. В контрольной группеварианты обнаружены не были. С высокой вероятностью данные вариантыассоциированысклиническойкартинойисследованныхпациентов.Примечательно, что в литературе ни один из этих кандидатов ранее не описан вассоциации с каким-либо заболеванием.

В базе MITOMAP при этом хранится 8геномовмтДНКсвариантомC12562G,однаковозможностианализафенотипических признаков носителей этого генотипа отсутствуют.Вариант А10732Т приводит к замене аспарагиновой кислоты на валин в 88позиции полипептидной цепи субъединицы ND4L НАДН-дегидрогеназного56комплекса.

Эта позиция высококонсервативна: согласно базе MITOMAP,межвидовой уровень консервативности составляет 97,78%. При данной замене,вероятнее всего, возникают физико-химические изменения в полипептиднойструктуре. Структура валина отличается от аспарагиновой кислоты (рис.3.1): валинимеет неполярный радикал и, следовательно, более гидрофобен; также егомолекулярная масса меньше: 117 г/моль, в то время как у аспартата – 133 г/моль.Рисунок 3.1. Структура аминокислот аспарагиновой кислоты (слева) и валина(справа).Дыхательный комплекс I, или НАДН-убихинон оксиредуктаза (также НАДНдегидрогеназа) – первый белок дыхательной цепи переноса электронов.

Комплексиграет центральную роль в процессе дыхания: именно он создает до 40%протонного градиента, необходимого для синтеза АТФ. Действуя по принципупротонной помпы, НАДН-дегидрогеназа обладает уникальным механизмомтранспорта протонов посредством конформационных изменений самого фермента.Комплекс окисляет 1 молекулу НАДН и восстанавливает 1 молекулу убихинона,при этом сквозь мембрану переносится 4 протона [85].Транспорт протонов происходит через 3 основных трансмембранных канала,образованных субъединицами ND2, ND4 и ND5, и через один дополнительныйканал, образованный малыми субъединицами ND6, ND4L и ND3.

Миссенс-заменав кластере ND4L, как одном из коровых элементов НАДН-дегидрогеназы, можетсерьезно влиять на общую функцию фермента [86].57Согласно базе OMIM, мутации в ND4L приводят к развитию синдрома LHOH(Лебера) и другим нейропатиям.Миссенс-вариант C12562G приводит к несинонимичной замене лейцина навалин в 76 позиции полипептидной цепи субъединицы ND5 респираторногокомплекса I. Консервативность данного локуса составляет 80%. Лейцин и валин(рисунок 3.2) схожи по своим физико-химическим свойствам: обе являютсягидрофобными нейтральными алифатическими аминокислотами с разветвленнымибоковыми цепями.

Остатки этих аминокислот участвуют в гидрофобныхвзаимодействиях, которые поддерживают третичную структуру белка [87].Помимо такой общей структурной роли, они важны для связывания субстратов(НАДНиубихинона)[70].Аминокислотынесколькоразличаютсяпомолекулярной массе: 131 г/моль у лейцина и 117 г/моль у валина.Рисунок 3.2. Структура аминокислот лейцина (слева) и валина (справа).Кластер ND5 является лимитирующим в электронно-транспортной цепиНАДН-дегидрогеназы [88]. Кроме того, ND5 вместе со своими антипортгомологами ND2 и ND4 образует три основных протонных канала, по которымпроисходит транспортировка протонов внутрь органеллы.

При этом от С-концаND5 отходит две трансмембранные спирали, которые физически связывают все триканала, и вероятно, участвуют в сопряжении транспорта электронов сконформационной перестройкой комплекса [89]. В связи с этим, изменения в58полипептиднойпоследовательностисубъединицымогутприводитьксущественному ухудшению процесса клеточного дыхания.Патогенные мутации в субъединице ND5 приводят к развитию такихсиндромов как MELAS, LHOH, Ли, а также к недостаточности комплекса I [10].Согласно базе данных OMIM, недостаточность комплекса I является наиболеераспространеннымдефектомпринарушениипроцессовоксидативногофосфорилирования.

Согласно масштабному исследованию более чем 100 семейнарушения именно митохондриально-кодируемых кластеров наиболее частослужат причиной развития недостаточности комплекса I у детей [90].Рассмотренные часто встречающиеся у пациентов с ЭМП варианты приводятк аминокислотным и, как следствие, физико-химическим изменения структурысубъединиц дыхательной цепи митохондрий.

Также существуют косвенныенаучные данные в пользу того, что подобного рода варианты могут влиять наклинический фенотип. Более подробная аннотация патогенности данных вариантовописана в разделе 3.1.4. Однако, прежде рассмотрим корреляции выявленныхгенотипов с клиническими признаками пациентов.3.1.3.1. Взаимосвязь вариантов A10732T и C12562G с клинической картинойпациентовЧисло пациентов, у которых клинически диагностирован нервно-мышечныйсимптомокомплекс, значимо больше при генотипах C12562G и A10732T (здесь идо конца раздела таблицы 3.3 и 3.4). Также, при наличии варианта C12562Gзначимо больше пациентов страдают от ацидурии, а при наличии A10732T – отчастых ОРВИ.

С другой стороны, при C12562G, напротив, частота респираторныхинфекций ниже. Среди потенциально протективных эффектов генотипа можноотметить также достоверно меньшую долю прогрессирующих форм ЭМП, а такжеменьшее число проявлений побочных реакций поджелудочной железы.Согласно статистическим данным, оба варианта, C12562G и A10732T,связаны с нарушениями работы нервно-мышечной системы. При этом, этигенетические отклонения необязательно являются причиной патологического59процесса, а могут носить адаптационный или реактивный характер, в пользу чегоговорит их взаимосвязь с осложнениями заболевания.Таблица 3.3. Статистические параметры степени проявлений нервномышечного симптомокомплекса, а также осложнений заболевания в виде частыхОРВИ и ацидурии в группе пациентов с гаплотипом C12562G и в группе пациентовс иными гаплотипами.Группа:Параметр0 – норма,1- естьC12562GИнойр, Хи-гаплотипквадратнарушениеЧастые ОРВИНервномышечныйсимптомокомплексАцидурия083317100333112100736187р, точныйкритерийФишера0,0460,057<0,001<0,0010,0050,013Отдельного рассмотрения заслуживает группа из 10 пациентов, у которыхварианты C12562G и A10732T встречаются одновременно.

Из выборки пациентовс гаплотипом A10732T такие пациенты составили 83%, а из выборки с гаплотипомC12562G – 67%. В связи с этим, предположительно, два варианта являются частьюединогогаплотипа,ассоциированногосэнцефаломиопатическимсимптомокомплексом. Обнаружение лишь одного из них у некоторых пациентовможет быть связано с явлением гетероплазмии мтДНК.60Таблица 3.4.

Статистические параметры прогрессирования болезни, степенипроявленийнервно-мышечногосимптомокомплекса,атакжеосложненийзаболевания в виде частых ОРВИ и нарушения работы поджелудочной железы вгруппе пациентов с гаплотипом A10732T и в группе пациентов с инымигаплотипами.Группа:0 – признакПараметротсутствует,A10732T1- естьИнойр, Хи-гаплотипквадратр, точныйкритерийФишерапризнакПрогрессирова-01233ние заболевания10130333НервномышечныйсимптомокомплексЧастые ОРВИНарушения1913053617100714поджелудочнойжелезы150,0370,0320,0030,0040,0130,0190,0430,07532Очевидно, доля пациентов с рассматриваемым генотипом, у которых былидиагностированы тяжелые нарушения нервно-мышечной системы, достоверновыше (р=0,003 по критерию Хи-квадрат; р=0,004 по точному двустороннемукритерию Фишера) по сравнению с носителями иных генотипов (рис. 3.3.).61а)б)Рисунок 3.3.