Диссертация (Диагностическое значение определения особенностей митохондриальной ДНК при энцефаломиопатиях у детей), страница 2
Описание файла
Файл "Диссертация" внутри архива находится в папке "Диагностическое значение определения особенностей митохондриальной ДНК при энцефаломиопатиях у детей". PDF-файл из архива "Диагностическое значение определения особенностей митохондриальной ДНК при энцефаломиопатиях у детей", который расположен в категории "". Всё это находится в предмете "биология" из Аспирантура и докторантура, которые можно найти в файловом архиве РНИМУ им. Пирогова. Не смотря на прямую связь этого архива с РНИМУ им. Пирогова, его также можно найти и в других разделах. , а ещё этот архив представляет собой кандидатскую диссертацию, поэтому ещё представлен в разделе всех диссертаций на соискание учёной степени кандидата биологических наук.
Просмотр PDF-файла онлайн
Текст 2 страницы из PDF
Этопозволит интегрировать результаты молекулярно-генетического анализа вдиагностику в тех случаях отсутствия мутаций, достоверно ассоциированныхс заболеванием.Подтверждена информативность диагностической панели оценкиэкспрессии генов митохондриальных сетей для оценки функциональныхизменений, ассоциированных с нарушениями мтДНК, а также длядифференциальной диагностики нервно-мышечных заболеваний различногогенеза.Методология и методы исследованияДиссертационнаяработапредставляетсобойлабораторноемолекулярно-генетическое исследование биологического материала когортыпациентов детского возраста с митохондриальными энцефаломиопатиями сцелью выяснения внутриклеточных основ патогенеза данной нозологическойформы.Объект исследования: периферическая венозная кровь и биопсийныйматериал скелетной мышцы пациентов детского возраста с клиническимипризнаками митохондриальных энцефаломиопатий.9Предмет исследования: молекулярно-генетические характеристики(точечныевариантымитохондриальнойДНК,паттерныэкспрессиимитохондриальных генов) течения митохондриальных энцефаломиопатий иих взаимосвязь с основными диагностическими клинико-лабораторнымипараметрами.Дизайн исследования, в соответствии с Хельсинской декларациейВсемирноймедицинскойодобренномассоциациилокальнымгосударственного(1964),этическимбюджетногоотраженкомитетомобразовательноговпротоколе,Федеральногоучреждениявысшегообразования «Российский национальный исследовательский медицинскийуниверситетимениН.И.Пирогова»РоссийскойФедерации.ВМинистерстваисследованииздравоохраненияиспользовалисьметодысеквенирования и анализа экспрессии генов, а также статистические ибиоинфоматические инструменты анализа данных.Положения, выносимые на защиту:1.
При клинически выраженных энцефаломиопатиях необходима комплекснаяоценка изменений митохондриальной ДНК, включающая анализ какгаплогрупповых полиморфизмов, так и вариантов с неизвестной клиническойзначимостью.2. Доказана клинико-лабораторная эффективность оценки разработанногоавторомпоказателя«индекспатогенностимитохондриальнойДНК»,представляющего собой комплексную биоинформатическую характеристикумтДНК.3. Гаплогрупповая принадлежность может быть ассоциирована с отдельнымиэлементами клинической картины пациента, а также связана с конкретнымигенетическими вариантами.4. Анализ экспрессии генов является эффективным инструментом как дляфункциональной оценки изменений мтДНК, так и для дифференциальнойдиагностики нервно-мышечных заболеваний.105. Установлены диагностически значимые паттерны генной экспрессии примитохондриальных энцефаломиопатиях, а также корреляции этих паттернов свозрастом дебюта и характером течения заболевания.Степень дoстoвернoстиДoстoвернoсть результатoв исследoвания oпределяется дoстатoчнымoбъемoм и кoрректным фoрмирoванием (репрезентативнoстью) изучаемыхвыбoрoк, применением принципoв, технoлoгий и метoдoв дoказательнoймедицины, высoкoй инфoрмативнoстью сoвременных метoдoв oбследoвания,адекватнoстью математических метoдoв oбрабoтки данных пoставленнымзадачам.Сфoрмулирoванныевывoдыипрактическиерекoмендацииаргументирoваны и лoгически вытекают из результатoв исследoвания.Практическое использование результатов исследованияРезультаты исследования внедрены в практическую деятельностьотделения клинической генетики НИКИ педиатрии им.
академика Ю.Е.Вельтищева ФГБОУ ВО РНИМУ им. Н.И. Пирогова Минздрава России, атакже могут быть рекомендованы для применения при медико-генетическомконсультировании в медицинских учреждениях. Основные положениядиссертационнойработыиспользуютсявнаучно-преподавательскойдеятельности кафедры клинической лабораторной диагностики ФДПО ГБОУВПО РНИМУ им. Н.И. Пирогова Минздрава Росси.Публикации и апробация работыОсновные положения диссертационной работы отражены в 10публикациях, в том числе 7 – в журналах, рекомендованных ВАКМинобрнауки РФ и 3 – в зарубежных рецензируемых изданиях.Результатыработыдоложеныиобсужденынаконференции«International Conference on Biomarker Research in Clinical Medicine» (Париж,2018), а также на первом московском саммите «Nanostring technologies»(Москва, 2017).11ГЛАВА 1.
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ1.1. Структура и функции митохондрийМитохондрия—этоприсутствующаяпрактическипродуцирующаяклеточнуювысокоспециализированнаявовсехэнергиюорганелла,эукариотическихпутёмокисленияклеткахиорганическихсоединений. Митохондрии выполняют четыре основных функции в клетке,которые могут иметь значение для рассмотрения патофизиологии болезни. Вопервых, они продуцируют большую часть клеточной энергии в виде АТФ; вовторых, они генерируют и регулируют активные формы кислорода; в-третьих,митохондрии аккумулируют существенную часть цитозольного кальция; и вчетвертых,онирегулируютклеточныйапоптозпутемизмененияпроницаемости своих мембран [5].
Согласно последним исследованияммитохондриальный аппарат также играет важную роль в дифференцировкестволовых клеток, регуляции клеточного цикла, врожденном иммунномответе на патогены и стресс [6].Митохондрии схожи размером с бактериями, что составляет около 1мкм. Они обладают двумембранной структурой: внешней и внутреннеймембранами,мембраназаключающимипронизана2-3межмембранноенмпорами,пространство.черезкоторыеВнешняясвободнотранспортируются небольшие молекулы и ионы (весом до 5 кДа) [7].
Также,наружная мембрана снабжена рецепторными молекулами для распознаваниякрупных белков и некоторыми ферментами. Благодаря особым структурам,встроенным в мембрану, митохондрии могут перемещаться по клетке,используя элементы цитоскелета, и локализоваться в зонах наибольшегоэнергопотребления [8].Характерной особенностью строения митохондрий является структураих внутренней мембраны. Она компактизована в виде крист – обращенных вматрикс складок, что позволяет увеличить поверхность внутренней мембраныв несколько раз.
Внутренняя мембрана отгораживает основное пространство12органеллы – матрикс, в котором находятся белки цикла Креббса,митохондриальная ДНК и РНК, белки домашнего хозяйства и т.п. В то времякак наружная митохондриальная мембрана имеет пористую структуру ипрактически свободно пропускает ионы и небольшие незаряженныемолекулы, внутренняя митохондриальная мембрана является непроницаемымбарьером для всех ионов и молекул, которые могут быть транспортированычерез нее с помощью специальных белков-переносчиков, что создаетэлектрохимический потенциал внутренней мембраны [7].1.2. Митохондриальная биоэнергетикаЭнергетический баланс в клетках животных основан на доступностиАТФ – универсальной формы химической энергии.
Получение этой молекулывозможно двумя основными путями: субстратным фосфорилированием вжидкой фазе и мембранным фосфорилированием с использованием энергиитрансмембранного градиента протонов Н+. Таким образом, процессполностью зависит от доступности восстановительных эквивалентов НАДН.Митохондрии реализуют оба этих пути. Первый происходит на начальныхстадиях окисления субстрата в цитоплазме и заключается в гликолизе или bокислении [9].При гликолизе происходит расщепление глюкозы до двух молекулпирувата, НАД+ восстанавливается до НАДН, а также образуется молекулаАТФ. Далее пируват транспортируется в митохондрию с помощьюпируватдегидрогеназы, декарбоксилируется и соединяется с коэнзимом А,превращаясь в ацетил-КоА, НАДН + Н+ и СО2. Затем ацетил-КоА принимаетучастие в цикле трикарбоновых кислот, промежуточном этапе междугликолизом и электронной транспортной цепью митохондрий.
В процессецикла Кребса происходит окисление органических кислот с выделением 2молекул СО2, трех НАДН + Н+, одной ФАДН2 и одной молекулы ГТФ (илиАТФ). Компоненты ЦТК у эукариот находятся в свободном состоянии вматриксе митохондрий, лишь сукцинат-убихинон-оксиредуктаза (комплекс II13электрон-транспортной цепи, ЭТЦ) закреплена на внутренней мембране. Настадии окисления сукцината восстановительный эквивалент перемещаетсяферментом на другой свой сайт – сайт связывания убихинона [10].Жирные кислоты гидролизуются в матриксе митохондрии путем bокисления с образованием нескольких (в зависимости от структуры субстрата)ацетил-КоА, НАДН + Н+ и ФАДН2. Далее два восстановительных эквивалентапереносятся на убихинон, и все дальнейшие процессы происходят на кристахвнутренней мембраны органеллы [6].1.3.
Окислительное фосфорилирование и электрон-транспортная цепьмитохондрийПоследняя стадия клеточного дыхания заключается в окислительномфосфорилировании через ЭТЦ на внутренней мембране митохондрий. Вовремя этого процесса происходит окисление НАДН + Н+ и ФАДН2 до НАД+и ФАД+ соответственно, создается трансмембранный градиент протонов Н+,что запускает АТФ-синтазу и, в конечном итоге, служит энергией длявыработки этим ферментом АТФ [7].Системаокислительногофосфорилированиясостоитизпятибиохимически (а в некоторых случаях, и физически) связанных друг с другомбелковыхкомплексов.КомплексI,НАДН-убихинон-оксидоредуктаза,катализирует отщепление двух электронов от НАДН, которые, перемещаясьпо структурам комплекса, в конечном счете, попадают на молекулу убихинона[9].Комплекс II, сукцинатдегидрогеназа, напрямую не связан с остальнымикомпонентами ЭТЦ, не входит он и в респирасомы – супрамолекулярныеконгломераты из комплексов окислительного фосфорилирования.