Диссертация (Диагностическое значение определения особенностей митохондриальной ДНК при энцефаломиопатиях у детей), страница 15

Крометого, при работе с группами, составленными на основе кластерного анализа,выявлена существенно большая однородность распределения значений экспрессииисследуемых генов по сравнению с группами, составленными на основепредварительного клинического диагноза. Это демонстрирует необходимостьиспользования оценки экспрессии генов как одной из диагностических процедур.Такойанализпредставляетсянаиболееактуальнымдлясложныхклинических картин несиндромальных форм нервно-мышечных заболеваний. Какизвестно, среди митохондриальных заболеваний выделено всего около двухдесятков основных синдромов [3]. Эти синдромы считаются классическими, таккак клинический подход к их диагностике остается неизменным на протяжениипоследнего десятилетия. Генетический анализ, при этом, служит скорее в качествевспомогательного инструмента верификации диагноза.

Однако подавляющеебольшинствомитохондриальныхзаболеванийпредставляетсобойтруднодифференцируемый спектр мультисистемных нарушений (чаще всего –энцефаломиопатий), симптомы которых перекрываются и маскируются другдругом [48]. Анализ экспрессии генов, рассматриваемых в нашей работе, можетслужить эффективным инструментом дифференциальной диагностики таких формзаболевания.При этом, как видно из результатов, диагностическая панель необязательнодолжна включать в себя большое число генов: достаточным количеством могутявляться54верифицированныхгена,значениякоторыхдостоверноивоспроизводимо различаются между группами мтЭМП и МД. В нашемисследовании, несмотря на небольшой размер выборки, можно предварительноговорить не только о достоверности, но и о воспроизводимости результатов.Анализируемые данные были получены в четырех разнесенных во временизапусках цифрового анализатора (по 12 пациентов в каждом), причем в каждом111запуске присутствовали пациенты каждой из трех групп.

Таким образом,однородность значений генной экспрессии в группе, скорее всего, не связана сметодической последовательностью выполнения исследования.3.2.5. Глубокий анализ генных сетейС одной стороны, информация о генах, достоверно различающихся междунозологическими формами мышечных заболеваний, сама по себе может служитьосновой для создания соответствующей диагностической панели.

С другойстороны,использованиестатистическихзакономерностейбезпониманияфизиологического смысла изменений может приводить к ошибочной трактовкерезультатов и снижению специфичности анализа. Основным ключом космыслению выявленных различий может служить лишь анализ генных сетей, вкоторых задействованы рассматриваемые гены, поиск общих внутриклеточныхмишеней и регуляторов. Среди перечисленных в таблицах 3.15-3.17 генов быливыделеныфункциональныегруппы,ассоциированныесопределеннымирутинными или патологическими клеточными процессами, сигнальными путями,транскрипционными факторами и иными регуляторами – на основании имеющихсяв научной литературе данных.3.2.5.1.

Вовлеченность в процессы митохондриальной жизнедеятельностиНижепредставленыосновныепроцессы,ассоциированныесфункционированием митохондрий, в которые вовлечены гены из рассматриваемойвыборки.1. Генерация активных форм кислорода. Вовлечен 31 ген (рис. 3.29),р=8.64710е-17, коэффициент сходства Жаккара 5.49061е-3;2. Биогенез и организация митохондрий. Вовлечено 11 генов (рис. 3.30),р=1.66710е-9, коэффициент сходства Жаккара 1.18662 е-2;3. Репликация митохондриальной ДНК. Вовлечено 9 генов (рис. 3.31),р=5.68476 е-14, коэффициент сходства Жаккара 4.61538е-2.112Рисунок 3.29. Гены, уровень экспрессии которых значимо различается междугруппами пациентов, вовлеченные в процесс генерации активных формкислорода.Рисунок 3.29. Гены, уровень экспрессии которых значимо различается междугруппами пациентов, вовлеченные в процесс генерации активных формкислорода.На рисунке представлены гены: FXN, NDUFV1, NDUFS3, PDP1, NDUFS4,NDUFV2, NDUFS2, SDHB, OPA1, SDHA, CYCS, МТ-ATP8, CPT1A, ATP5E, CYTB,HSPB1, МТ-ATP6, GSR, ABCB6, FH, HIF-1Α, TUFM, ND2, NDUFA1, МТ-ND5, МТND6, COQ2, МТ-ND4, DIABLO, MTRR, POLG.113биогенезмитохондрийРисунок 3.30.

Гены, уровень экспрессии которых значимо различается междугруппами пациентов, вовлеченные в процесс биогенеза и организациимитохондрий.На рисунке представлены гены: POLG2, COX10, OPA1, CYCS, FXN, HIF-1Α,TUFM, CPT1A, NDUFS4, POLG, МТ-ATP6.репликациямтДНКРисунок 3.31. Гены, уровень экспрессии которых значимо различается междугруппами пациентов, вовлеченные в процесс репликации митохондриальнойДНК.На рисунке представлены гены: POLG2, OPA1, DGUOK, FXN, C10orf2, POLG,HIF-1Α, HSPA14, ATP6.114Генерация активных форм кислородаАФК постоянно образуются в клетке как продукты нормального метаболизмакислорода.

До 95% АФК затем восстанавливается до воды в митохондриях спомощьюокислительногоосуществляетсяфосфорилирования.несколькимиТакжезащитаантиоксидантнымиотАФКферментами(супероксиддисмутаза, каталаза и пероксиредоксины) и низкомолекулярнымиантиоксидантами (витамин С, глутатион, мочевая кислота) [94]. При нарушенииработы комплексов дыхательной цепи, АФК накапливаются в избытке и приводятк окислительному стрессу. Хорошо известно, что окислительный стресссопутствует гипоксии при мышечных дистрофиях, структурных мышечныхдефектах (врожденных структурных миопатиях) и первичных митохондриальныхнарушениях [57] .В группе 2 пациентов с миодистрофией существенно выше по сравнению сгруппой 1 (мтЭМП) экспрессия GSR – фермента глутатионредуктазы, котораявосстанавливает дисульфидную связь окисленного глутатиона GSSG до егосульфгидрильной формы GSH, в результате чего глутатион приобретаетантиоксидантные свойста [95].

Также у этих пациентов усилен биогенез CPT1A –карнитин-пальмитоилтрансферазы I, которая катализирует перенос ацильнойгруппы от молекулы ацил-CoA жирных кислот с длинной углеводородной цепьюна молекулу карнитина, с образованием ацилкарнитина и свободной молекулыкофермента А. Тем самым CPT1A регулирует антиоксидантные свойства Lкарнитина [96].

Повышена и продукция мРНК COQ2 – окислительновосстановительноголипофильногопереносчикапара-гидроксибензоатполипренилтрансферазы или убихинона, который помимо участия в работедыхательной цепи, также являющегося важным антиоксидантным фактором [97].Также в группе 2 значимо выше по сравнению с группой мтЭМП содержаниемажорного транскрипта ABCB6 – одного из белков суперсемейства АВСтранспортеров, который может проникать сквозь гематоэнцефалический барьер ислужит антитоксическим (в том числе против агентов экстракорпорального115происхождения) и антиоксидантным фактором [98].

Существенно выше при МД иэкспрессия фумаразы FH, которая является центральным ферментом в биосинтезефумарата – конечного акцептора электронов в окислительно-восстановительныхреакциях [99]. Наконец, косвенно связанные с генерацией АФК, белки тепловогошока HSP-семейства также сильнее экспрессируются в группах 2 и 3 по сравнениюс пациентами с мтЭМП.

Также в группах 2 и 3 наблюдается повышение экспрессиирегуляторов трансляции митохондриальных белков, таких как MTRR, FXN, TUFM,OPA3, а также множества субъединиц дыхательной цепи: NDUFV1, NDUFS3,PDP1, NDUFS4, NDUFV2, NDUFS2, SDHB, SDHA, CYCS, МТ-ATP8, ATP5E, CYTB,МТ-ATP6, МТ-ND2, NDUFA1, МТ-ND5, МТ-ND6, МТ-ND4.В группе пациентов с мтЭМП относительно групп 2 и 3 повышено лишьсодержание мРНК гипоксического фактора HIF-1Α и проапоптотического фактораDIABLO.Можно предположить, что повышенная генерация АФК при мышечныхдистрофиях и митохондриальных ЭМП имеет кардинально разные последствия дляклетки.

В случае дистрофий и врожденных миопатий, вероятно, запускаетсяпроцесс адаптации к митохондриальным нарушениям, в частности усиливаетсяэкспрессия антиоксидантных факторов и факторов биогенеза митохондрий (болееподробно приведено в следующем разделе). При мтЭМП повреждениямитохондриальной ДНК, вероятно, не позволяют полноценно запустить процессадаптации к окислительному стрессу, в связи с чем клетка направляется поапоптотическому пути.Биогенез и организация митохондрийСогласно полученным данным, при митохондриальных энцефаломиопатияхпроисходит угнетение процессов репликации и транскрипции митохондриальнойДНК (схема процессов представлена на рисунке 3.32). В частности, сниженаэкспрессия генов ДНК-полимеразы гамма (POLG и POLG2), геликазы TWINKLE,денатурирующейкороткиеотрезкимтДНКприрепликации(C10orf2),дезоксигуанинкиназы, отвечающей за фосфорилирование дезоксинуклеотидов116(DGUOK), а также генов, отвечающих за индукцию биосинтеза белков (FXN) и заиндукцию процесса репликации мтДНК в целом (HSPA14) [100].