Диссертация (Диагностическое значение определения особенностей митохондриальной ДНК при энцефаломиопатиях у детей), страница 17

Чаще всего это происходит при повышенномэнергопотреблении клетки, например, при серьезных физических нагрузках.Однако при патологии митохондриального аппарата глюкоза усваиваетсянедостаточно эффективно, в связи с чем клетка, теоретически, может восприниматьбазовый уровень физической активности как чрезмерный. В результатеусиливается синтез элементов респираторной цепи, наблюдаемый в группепациентов с мтЭМП.АМФ-активируемаяпротеинкиназаΑMPKврезультатенарастанияконцентрации АМФ изменяет энергетический баланс клетки. Она ингибируетсинтез жирных кислот и активирует их окисление, т.е., переводит клетку вэнергосберегающее состояние. В частности, АМРК является регулятором mTOR –мишенирапамицинамлекопитающих,протеинкиназысерин-треониновойспецифичности (рис.3.36) [107]. АМРК ингибирует транскрипцию RPTOR,регуляторного ассоциата mTOR. С другой стороны, АМФ-активируемаяпротеинкиназа фосфорилирует TSC2, который в свою очередь ингибирует RHEB –активатор mTOR и RPTOR.

В результате этих событий активность mTOR падает, исоответственно снижается пролиферативный потенциал клетки [104]. Похожиймеханизм запускает и индуцируемый гипоксией фактор HIF-1Α, активируя такиеблокаторы RHEB, как TSC1 и BNIP3 [108].Cα2+ сигналлингПредположительно, при нарушении работы митохондрий происходит сдвигмолекулярного восприятия базовых физических нагрузок. Аномальная реакцияможет проявляться на уровне синаптической нервно-мышечной передачи.

Вчастности, при долгосрочной избыточной мышечной нагрузке нейромедиаторглутамат в большом количестве накапливается с внешней стороны клетки ивызывает поступление внутрь мощного потока ионов кальция через NMDΑ-124рецепторы.Кальциеваяперегрузка(рис.3.38)приводиткповреждениюмитохондриальной кальций-транспортной системы, а также к увеличениюэкспрессии проапоптотических генов и снижению активности антиапоптотическихфакторов[109].Внормекальций/кальмодулин-зависимуюкальцийзапускаетпротеинкиназу,киназныекаскады:фосфоинозитид-3-киназу,митоген-активируемую киназу (MΑPK1 и MΑPK3). Каскад фосфорилирования, витоге, достигает ΑKT1, mTOR и CREB, которые интенсифицируют экспрессиюгенов,ответственныхзаклеточнуюпролиферацию,иингибируютпроапоптотические факторы GSK3B, BΑD, FOXO1 [110]. При кальциевойперегрузке происходит запуск митохондриального пути клеточного апоптоза, чтообуславливает нарушения работы скелетных мышц на тканевом уровне [111].Отдельно стоит отметить, что кальциевая эксайтотоксичность – патологическийпроцесс гибели нейронов в результате гиперактивации NMDΑ-рецепторов – можетвызыватьишемическийкаскадиразвитиепатологиивысшейнервнойдеятельности, которая является частым симптомом у пациентов с мтЭМП [112].Сигнальный путь SIRT3Некоторые из измененных генов участвуют в сигналлинге SIRT3 – НАДзависимойдеацетилазы.Митохондриальныйсиртуин3отвечаетзадеацетилирование гистоновых белков, регулируя плотность упаковки мтДНК, исоответственно, процессы транскрипции и трансляции (см.

рис.3.37) [113]. Сегоднясемейство сиртуинов рассматривается как один из важнейших факторовдлительности жизни, так как они напрямую влияют на активность работыреспираторной цепи митохондрий и продукцию АФК [94]. В нашем исследованииу пациентов с мтЭМП увеличена экспрессия таких мишеней SIRT3, как SDHΑ,SDHB, ΑCΑD8 и MT-CYB, а у пациентов с миодистрофиями – ΑLDH18Α1,NDUFS6 и ΑTP5E. Судя по всему, нарушения при рассматриваемых заболеванияхзапускают внутриклеточный каскад, затрагивающий в том числе и генную сетьсиртуинов.

Направление этого каскадного процесса и его фенотипическийрезультат требуют дальнейшего изучения.125Реализация описанных выше сигнальных каскадов согласно полученнымданным происходит схоже у пациентов с нервно-мышечными заболеваниямиразличного генеза. Вероятно, краеугольное различие лежит в масштабах этойреализации и её направленности. Однако белки, отвечающие за первичные этапыданных каскадов, находятся вне митохондриальных генных сетей. Анализэкспрессии сетей каждого из регуляторов заслуживает отдельного масштабногоисследования. Предполагаемые общие регуляторы для отдельных групп генов израссматриваемой выборки будут приведены в следующем разделе.126Рисунок 3.36. Активация АМРК и mTor в результате недостаточности глюкозы.127Рисунок 3.37. Сигналлинг SIRT3128Рисунок 3.38.

Нарушение кальциевого баланса1293.2.5.4. Поиск общих регуляторов1. NFE2L2 является регулятором 9 генов (рис.3.39), р=7.57753 е-6, коэффициентсходства Жаккара 1.67910 е-2;2. NRF1 является регулятором 8 генов (рис.40), р=1.85169 е-2, коэффициентсходства Жаккара 4.90798 е-2;3. TFΑM является регулятором 6 генов (рис.41), р=1.53690 е-9, коэффициентсходства Жаккара 7.50000 е-2;4. SOD2 является регулятором 5 генов (рис.42), р= 2.81856 е-6, коэффициентсходства Жаккара 4.16667 е-2;5. PΑRK2 является регулятором 4 генов (рис.43), р=9.61654 е-5, коэффициентсходства Жаккара 3.14961е-2;Рисунок 3.39. Гены сети NFE2L2, различающиеся между группами пациентов смышечными дистрофиями и митохондриальными энцефаломиопатиямиНа рисунке изображены гены GSR, ΑBCB6, SDHB, CYCS, HIF-1Α, FXN, NDUFV1,C10orf2, CYTB.130Рисунок 3.40.

Гены сети NRF1, различающиеся между группами пациентов смышечными дистрофиями и митохондриальными энцефаломиопатиями.На рисунке изображены гены ΑBCB6, SDHB, SDHΑ, CYCS, NDUFV1, NDUFS4,POLG, CYTBРисунок 3.41. Гены сети TFΑM, различающиеся между группами пациентов смышечными дистрофиями и митохондриальными энцефаломиопатиями.На рисунке изображены гены CYCS, ΑTP8, NDUFS4, CYTB, ND2, ΑTP6.131Рисунок 3.42. Гены сети SOD2, различающиеся между группами пациентов смышечными дистрофиями и митохондриальными энцефаломиопатиями.На рисунке изображены гены OPΑ1, FH, FXN, HIF-1Α, CYTB.Рисунок 3.43. Гены сети PΑRK2, различающиеся между группами пациентов смышечными дистрофиями и митохондриальными энцефаломиопатиямиНа рисунке изображены гены OPΑ1, HIF-1Α, NDUFS3, NDUFS4.132ОбсуждениеNFE2L2 – транскрипционный фактор типа лейциновых застежек-молний.

Внорме его содержание в клетке мало, так как он находится под контролем кластерабелков, активно деградирующих его. Однако, при окислительном стрессе белкирегуляторного кластера снижают свою активность, в результате чего концентрацияNFE2L2 в цитоплазме повышается, и часть молекул транспортируется в ядро. Тамфактор инициирует транскрипцию ряда генов антиоксидантов, в том числе иисследованных в работе [114].NRF1–метаболическихтранскрипционныйгенов,фактор,регулирующихактивирующийклеточныйрост;рядключевыхядерныхгенов,ответственных за дыхательную цепь митохондрий, а также митохондриальнуютранскрипцию и репликацию, том числе ΑBCB6, SDHB, SDHΑ, CYCS, NDUFV1,NDUFS4, POLG, CYTB.

Белок NRF1 совместно с NRF2 координирует работуядерного и митохондриального геномов [100].TFΑM – митохондриальный транскрипционный фактор А, активируетбиогенез основных белков дыхательной цепи, а также участвует в репликациимтДНК [112].SOD2–марганец-зависимаясупероксиддисмутаза2.Этотбелоктрансформирует супероксидный радикал, побочный продукт митохондриальнойэлектронно-транспортной цепи, в перекись водорода и двухатомный кислород.Экспрессия данного фактора была исследована в работе, однако достоверныхразличий между группами пациентов не выявлено [94].PΑRK2 – убиквитин-лигаза, играющая ключевую роль в убиквитинировании.Этот процесс заключается в ковалентном присоединении одного или несколькихмономеров убиквитина к белку-мишени, что приводит к его протеолитическойдеградации.

В частности, PΑRK2 распознает и направляет поврежденныемитохондрии по пути их расщепления. Кроме того, этот фактор увеличивает133выживаемостьклетокзасчетподавлениямитохондриальногоинемитохондриального путей апоптоза [61].Выявленные общие регуляторы генов, экспрессия которых значиморазличаласьмеждуразнымигруппамипациентов,служатещеоднимподтверждением активации молекулярного ответа на окислительный стресс,который характерен для скелетной мышечной ткани при разных типах нервномышечных заболеваний. Все рассмотренные факторы, за исключением SOD2, небыли представлены в исследовательской панели, однако заслуживают дальнейшегоизучения.Мы предполагаем, что для повышения диагностической эффективностианализа экспрессии генов следует совершить переход от исследования генов,непосредственносвязанныхсфункционированиеммитохондриальнойдыхательной цепи (таких как субъединицы дыхательных комплексов) крегуляторам более широкой направленности внутриклеточного сигналлинга.

Привыявлении количественных соотношений между этими двумя типами молекул,диагностическая панель может быть сведена к меньшему количеству генов, чтоявляется преимуществом с точки зрения биоинформатического анализа данных.При этом информативность получаемых данных повысится, поскольку они будутиндицировать запуск внутриклеточных каскадов, которые на фенотипическомуровне отражаются в отсутствии или избыточности какого-либо структурногоэлемента митохондриального аппарата.3.2.5.5. Вовлеченность в патологические процессы1. Апоптоз. Вовлечены гены DIABLO, CYTB, OPA1, NDUFV1, NDUFV2, CYCSр=7.29295 е-7, коэффициент сходства Жаккара 3.52113 е-2;2.

Гипоксия. Вовлечены гены CYTB, NDUFV1, NDUFV2, HIF-1Α, р=3.89863 е-5,коэффициент сходства Жаккара 2.48447 е-2;134АпоптозХорошоизвестно,чтовысокореакционныеАФК,образующиесявмитохондриях всех аэробных клеток, являются важнейшим триггером апоптоза. Вфизиологическихусловияхихдеструктивноедействиесдерживаетсямногоуровневой системой антиоксидантов. Однако при дисбалансе образования иутилизации АФК, клетка может предрасполагаться к программируемому лизису[108].

Показано, что при разных формах индуцированного апоптоза выявленысниженияактивностиэлементовантиоксидантнойзащитыклеток[115].Митохондриальный апоптотический путь развивается с участием белков Bak, Baxи некоторых других (рис. 3.44). Олигомеризуясь и встраиваясь в мембрануорганеллы, эти молекулы образуют поры. В результате, нарушается осмотическийбаланс внутренней плазмы митохондрий, внутрь поступает большое количествомолекул кальция, а в цитоплазму клетки из мембраны высвобождаются молекулыцитохрома С. В результате запускается клеточный аутолизис [116]. Насегодняшний день нет однозначного ответа на вопрос, что первично:окислительный стресс или апоптотический каскад, однако между этимипроцессами несомненно существует тесная взаимосвязь.Согласно полученным нами данным, у пациентов с митохондриальнымимиопатиямиповышенаэкспрессиягенаDIABLO,которыйсвязываетантиапототический фактор и запускает каспазные каскады, приводящие к гибеликлетки.