Диссертация (Патофизиологическое значение ацетилхолина в пролиферации опухолевых клеток толстой кишки in vitro и in vivo), страница 11

СОБСТВЕННЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ3.1. Биологические эффекты от воздействия ацетилхолина на опухолевыеклетки SW6203.1.1. Определение рабочих концентраций раствора ацетилхолина для invitro исследованийДля изучения влияния Ах на ОК SW620 in vitro требовалось установитьдиапазон рабочих концентраций раствора для внесения в популяцию. Дляэтого оценивали дыхательную и пролиферативную активность, а такжепроницаемость мембраны для красителей.Для оценки дыхательной активности клеток проводили исследованиеметодом МТТ, который позволяет определять цитотоксические эффекты отпрепарата и уточнять нетоксический диапазон его действия.

В группу быливключены исследования, проведенные на клетках разных пассажей. Всегобыло проведено 9 экспериментов для двадцати четырех, и девяноста шестичасов инкубации, и 15 экспериментов – для семидесяти двух часов.Результаты исследований представлены в таблице 5.Установлено, что Ах подвергается гидролизу в первые часы инкубации,что обусловливает высокую токсичность для ОК при 24 часах инкубации.

Внашей работе было выдвинуто предположение о том, что Ах в высокихконцентрациях (0,25-0,06М) может влиять на активность клеточного дыханияи замедляет пролиферацию. Наблюдаемый цитотоксический эффект был, повидимому, связан с действием уксусной кислоты, которая образуется впроцессе гидролиза молекулы Ах в первые часы инкубации. Этот механизмцитопатического действия высоких концентраций Ах описан для многихпатофизиологических процессов.64Таблица 5Процент жизнеспособных, дышащих опухолевых клеток SW620,обработанных Ах по отношению к контрольнымКонц.Ах влунке,М00,25% живых, дышащих клетоквремя инкубации24 часа72 часа96 часовМе(25;75)%Ме(25;75)%Ме(25;75)%100100,0;100,0 100,0** 100,0/100,0100,0100,0/100,08,0*/°62,6;69,037,5;46,5 41,6***/◊ 37,9;42,844,7**0,1258,1*/°87,0;89,662,0**59,2;64,155,9***/◊52,8;61,70,069,7*/°90,2;94,976,5**/#75,0;78,866,6***/◊64,1;70,80,0395,6*/93,7;99,491,5**90,6;93,369,0***/◊65,9;72,80,015113,8*/°95,7;102,090,1**/#89,9;90,964,2***/◊52,0;76,610-4130,3*/°86,8;99,091,7**/#84,7;88,777,9***/◊68,5;84,410-5163,0*88,1;100,094,3**91,9;99,783,8***81,2;90,510-6167,8*86,3;100,96,8**94,5;100,588,9***74,3;93,8(*) р = 0,02 Aver.

rank r = 0,67, Coeff of concordance = 0,78 при сравненииоптических плотностей между лунками с интактными и экспериментальными клетками (FriedmanANOVA and Kendall Coeff. of Concordance)(**) p = 0,0001 Aver. rank r = 0,68325, Coeff. of Concordance = 0,75 при сравнении оптическихплотностей между лунками с интактными и экспериментальными клетками (Friedman ANOVA andKendall Coeff. of Concordance)(***) p = 0,005 Aver.rank r = 0,79798, Coeff. of Concordance = 0,86 при сравнении оптическихплотностей между лунками с интактными и экспериментальными клетками (Friedman ANOVA andKendall Coeff. of Concordance)(#) p = 0,008 ANOVA Median Test, сравнение показателей выживаемости клеток при инкубации 24 и72 часа после добавления Ах до конечных концентраций 0,06 и 0,015М.(°) p = 0,01 ANOVA Median Test, сравнение показателей выживаемости клеток при инкубации 24 и96 часа после добавления Ах.(◊) p = 0,047 ANOVA Median Test, сравнение показателей выживаемости клеток при инкубации 72 и96 часа после добавления АхИз таблицы видно, что обработка клеток Ах в концентрации 0,25-0,06 Мвызывает цитотоксический эффект, что является достоверным наблюдением.Было обнаружено, что в месте внесения высокой концентрации раствора65клетки погибали, а окружающие их соседние откреплялись с пластика и/илимигрировали как можно дальше к углам лунок планшетов, что, возможно,было связано с резкиме снижением рН СК сразу после внесения раствора.Таким образом, для дальнейшей работы необходимо было установить влияниерН СК на клетки.

Для этого с помощью тест-полосок и рН-метра былипроврены динамические измерения рН, в точках 24, 48, 72 и 96 часов, которыепоказали, что физиологически комфортные для культуры ОК условияустанавливались через 20-24 часа с момента внесения, кроме конечныхконцентраций Ах 10-3М, 10-4М, и 10-5М, которые достигали значения 7,3-7,4практически сразу (4-8 час). Поскольку выявленные колебания рН СКявляются важным фактором при работе с растворами Ах и должныучитываться в работае с клеточными культурами, для которых комфортноезначение рН СК достаточно узкое и составляет 7,2-7,4 в последующихэкспериментах для нейтрализации колебания уровня рН в СК ОК добавлялираствор HEPES-Na соли.

Из таблицы видно, что 50% гибели клеток (IC50) приинкубации в течении 72 часов наблюдали при концентрации Ах 0,25 М, а при96 часах – при 0,125 М. Очевидно, что при 24 ч. инкубации, начиная сконцентрации Ах 0,015 М и меньше, существует стимулирующий эффект наобразование конъюгата «МТТ-эстераза», чем скорее всего и объясняетсявысокий процент выживаемости клеток (более 100%). Так как результатылюбогоМТТ-анализаследовательно,показываютжизнеспособныхизменениеклеток),нопроцентанедышащихучитывают(и,клетки,погибшие/находящиеся в процессе аутофагии и/или на ранней стадииапоптоза, нами были проведены сравнения контрольной и экспериментальнойгруппдлякаждойвременнойточкисцельюуточненияспектрацитотоксичности препарата.Установлено, что максимальнаяскорость образованиямонослояприходилась на период между 48-м и 72-м часом инкубации, что видно изтаблицы 6.66Таблица 6Тест изменения скорости удвоения, образования колоний1524487296Кон. конц-ия Ах,МКол-во полныхудвоенийклетки, разСр.

кол-воколоний на ч.Петри, шт010-3М10-4М10-5М10-6M010-3М10-4М10-5М10-6M010-3М10-4М10-5М10-6M010-3М10-4М10-5М10-6M000001-21-20-11132-33334344400000000003,64,80003,64,80-100Среднее кол-воклеток вшарообразныхобразованиях, штук0-544,8770-8,446,87716,418,222,817,817,916,422,020,821,021,2Через 72 часа инкубации с Ах угнетение клеточного дыхания носиловремя- и дозозависимый характер.

Выявленная тенденция к сокращению числажизнеспособных клеток может быть объяснена началом контактноготорможения роста ОК, которое можно было наблюдать при микроскопии.Не исключено, что лимитирующим фактором для роста и дыханиякультуры служило истощение питательных веществ и изменение рН средыкультивирования (еѐ закисление). Подтверждением данного факта являетсяизменениескоростиудвоенияклеток.Дляпроверкидостоверностивыявленного времяопосредованного эффекта от применения Ах на процесспролиферации и, следовательно, дыхательную активность ОК было проведено67сравнение показателей жизнеспособности одноименных групп в разное времяинкубации.Также было установлено, что при инкубации клеток 72 часа с нецитотоксическимистатистическиконцентрациямизначимоеАхдозозависимое(0,015-10-4М)наблюдалосьуменьшениеколичестважизнеспособных клеток, которое не выявляли при сроках инкубации 24 часа,но усиливалось к 96-ому часу. Этот эффект на наш взгляд связан с динамикойклеточного деления - первое деление популяции происходит через 36 часов, иколичество клеток достигает пика к 72 часам.

Полученные данные былиподтверждены тестом на удвоение клеточной популяции что представлено втаблице 6. Показано что максимальная скорость образования монослояприходилась на период между 48-м и 72-м часом инкубации; через 72 часаинкубациисАхугнетениеклеточногодыханияносиловремя-идозозависимый характер. Выявленная тенденция к сокращению числажизнеспособных клеток может быть объяснена началом контактноготорможения роста ОК, которое можно было наблюдать при микроскопии.Представленные данные можно интерпретировать двояко: с однойсторны Ах может вызывать стимуляцию клеточного дыхания с 24-ого и до 72ого часа инкубации и таким образом выступать в качестве агента,активирующего пролиферацию; с другой стороны этот эффект не стойкий, ипропадает к 96-ому часу.

Полученные in vitro данные частично объясняютпричину актвной репарацию тканей организма в первые 72-96 часов послеповреждения и проясняют роль Ах в данном процессе, что согласуется срезультатами, полученными in vivo [44].В тоже время нельзя исключать влияние косвенных факторов наполученные результаты. Как установлено ранее, Ах способен индуцировать вклетках накопление оксида азота и усиливать деятельность ферментовдыхательной цепи [60; 176]. Этот фактор мог влиять на информативностьМТТ-метода.

Также на результаты МТТ-теста мог повлиять ряд факторовсреди которых рН среды культивирования [56], время инкубации с реактивом68[13], качество исходных клеток и состав среды, и др. было принято решение опроведениидополнительногоисследованияметодоминтернализациикрасителей.3.1.2.