Диссертация (Патофизиологическое значение ацетилхолина в пролиферации опухолевых клеток толстой кишки in vitro и in vivo), страница 14

В таблице 11 представлено сравнение изменения количества ММР-3и ММР-9 в супернатанте и внутри клеток в зависимости от времениинкубации. Учитывая физиологическую роль этих веществ изменятьспособность клеток к формированию межклеточных контактов, выявленныеизменения их концентрации в клеточном лизате и СК могут объяснитьизменение характера роста клеток и скорости удвоения клеточной популяции,которые были выявлены ранее, что согласуется с данными литературы, гдепоставлен вопрос о вовлеченности Ах именно в процессы межклеточноговзаимодействия опухолевых клеток [87; 93; 159; 180].Таблица 11Динамика изменения количества матриксных металлопротеиназ 3 и 9 типа впроцессе культивирования и статистическая значимость выявленныхизменений72 часа vs 96 часов, статистическая значимость выявленного эффектаКон.

конц-ии Ах,МАх 0 vs Ах 0Ах 10-4 vs Ах 10-4Среда культивированияММР-3ММР-9Дост.Дост.увеличениеуменьшениеДост.увеличениеКлеточный лизатММР-3ММР-9увеличениеувеличениеуменьшениеуменьшениеувеличениеАх 10-5 vs Ах 10-5увеличениеувеличениеуменьшениеуменьшениеАх 10-6 vs Ах 10-6увеличениеувеличениеуменьшениеувеличение823.1.5. Влияние ацетилхолина на экспрессию молекул главного комплексагистосовместимости человека первого и второго классовУчитывая характеристики первичной клеточной линии, из которой былаполучена SW620 [57] было выдвинуто предположение, что в определенныхусловиях Ах способен оказать влияние на процесс распознавания опухолевыхклеток иммунной системой. Наиболее вероятно, что его действие будетсвязано с увеличением количества молекул комплекса гистосовместимости наповерхности опухолевых клеток.

В настоящее время широко известна теорияопухолевого ускользания, впервые изложенная Бернеттом в 70-ые годы ХХвека [53] и имеющая серьезное развитие за последние два десятилетия.Следствием этого является теория, что дочерние клетки могут изменять своихарактеристики, в том числе благодаря окружающим тканям [26; 47], а вчастности клеткам-макрофагам, которые способны местно накапливатьАх [135]. Действие макрофагов способствует отбору опухолевых клонов,которые утратили некоторых поверхностные молекулы, в том числе имолекулы главного комплекса гистосовместимости [1; 78; 114; 119]. ВлияниеАхнаэкспрессиюповерхностныхмолекулглавногокомплексагистосовместимости описано для многих патологий, сопровождающихсявоспалением [15], включая рак [27; 72; 158], однако данных по исследованиямпроведенных на клеточных линиях в последние 10 лет мы не обнаружили.Изученное нами влияние Ах на появление молекул главного комплексагистосовместимости I и II класса на поверхности клеток SW620 былоисследовано методом проточной цитометрии.

Для этого в начале работы былиопределены стандартные характеристики линии при рутинном содержании,после чего был создан шаблон (настройки прибора) для дальнейшейэкспериментальной работы. Полученные в последующей работе данныепредставлены в таблице 12.83Таблица 12Количественная оценка клеток, экспрессирующих молекулы главногокомплекса гистосовместимости человека первого и второго классовМолекулы главногоВремяКонечныекомплексаинкубации,концентрациигистосовместимостичасы, n=9Ах, M072HLAI96072HLAII96Анализданных,% позитивных клетокМе(25;75)%042,632;52,8042,632;52,510-435,524,1;46,910-539,422,8;56,010-636,123,2;49,0046,431,4;60,710-436,218,3;65,910-550,526,8;79,510-642,422,6;62,208,88,4;9,108,78,4;9,210-44,31,5;7,010-58,77,7;9,710-611,98,7;14,805,42,3;7,910-45,32,2;5,810-55,35,1;5,910-67,41,7;8,4представленныхниже,показалотсутствиестатистически значимых различий и высокую степень гетерогенностипоказателейпредставленностиглавного комплекса гистосовместимостичеловека обоих классов на поверхности изучаемой линии.

Из таблицы видно,что время- и дозозависимых эффектов от воздействия Ах на экспрессию84молекул главного комплекса гистосовместимости человека в данной системене существует, чтоподтверждает статистическая оценка значимостиизменений - р>0,05.В настоящее время литературные данные не дают никакого ответа навопрос о влияния Ах на экспрессию молекул главного комплексагистосовместимости на ОК РТК, что требует уточнения ввиду егововлеченности в процессы иммунного ответа при воспалении.

Литературныеданные о том, что на поверхности нормальных энтероцитов существуютспецифические рецепторы для клеток иммунного ответа ставят вопрос о том,что изучение процесса распознавания антигенов ОК клетками иммуннойсистемы является важным для понимания процесса первичной трансформацииэнтероцита – как из нормального образуется гиперпластический полип и егопоследующую малигнизацию [109; 179].3.1.6. Влияние ацетилхолина на фазы клеточного цикла клеточнойлинии SW620У эукариот клеточный цикл состоит из четырех временных отрезков:собственно митоза (M), пресинтетической (G1), синтетической (S) ипостсинтетической (G2) фаз. Общая продолжительность как всего клеточногоцикла, так и отдельных его фаз значительно варьируют не только у разныхорганизмов, но и у клеток разных тканей и органов одного организма.Центральным событием клеточного цикла является репликация ДНК.Последовательно изменяющиеся фазы накопления пластического материала исамого деления на уровне единичной клетки приводят к ее удвоению ициклическому повтору этих событий до предела Хейфлика (в среднем 60делений), который определяет способность единичной клетки жить, не меняясвоих физиологических кондиций и давать полноценные дочерние клоны.Ввиду этого изучение фазы клеточного цикла является важным этапом висследовании агентов с пролиферативным свойством Пролиферация сложный физиологический процесс жизнедеятельности клетки, который85является итогом прохождения клеточного цикла.

Клеточная пролиферацияконтролируется сложной сетью внеклеточных и внутриклеточных событий,приводящих либо к инициации и поддержанию клеточного цикла, либо квыходу клеток в фазу покоя. В настоящее время предложены не иоизотопныеметоды (проточная цитометрия) исследования клеточного цикла, при которыхклеткиобрабатываюткрасителем,которыйможетфлуоресцироватьсвязавшись с ДНК. Флуоресценция окрашенных таким образом клеток прямопропорциональна содержанию в них ДНК. Далее определяют относительнуюяркость флуоресценции которая показывает содержание ДНК: с наименьшимколичеством ДНК - в фазе G1, клетки в фазах G2 и М содержат вдвое большеДНК, а в фазе S - промежуточное количество ДНК.

Гистограммы, полученныев результате этих исследования представлены на рисунке 12.Рисунок 12 Типичные настройки шаблона для определения фаз клеточногоцикла линии SW620 в начале эксперимента. Слева показано распределениеклеток популяции. Цветом выделены окрашенные клетки. Справа показанатипичнаягистограммаприпроведенииисследования.Осьабсцисс –интенсивность флюоресценции, нм; Ось ординат – количество клеток, тысячи.86Для того чтобы создать шаблон, ранее были проведены исследованиядля определения минимального необходимого количества жизнеспособныхклеток, необходимых для эксперимента. Было установлено, что этоколичество не должно быть меньше 87% (результаты по окраске ANV-Fitc/PIPE - позитивные клетки не более 10,5-12,5%).В дальнейшем методом ДНК-цитометрии определили относительноеколичество нативных (не обработаны Ах) клеток, на разных стадияхклеточного цикла до начала эксперимента и через 48, 72 и 96 часов рутинногокультивирования.

Это позволило отработать условия для проведенияманипуляций с клетками SW620 и таким образом, совместно с лабораториейэкспериментальной диагностики и биотерапии опухолей, был создан протоколдля работы с адгезивной культурой SW620 на проточном цитометре с цельюпроведения ДНК-цитометрии. В дальнейшей работе, полученные стандартныенастройки прибора использовали как оригинальный стандарт. Полученныерезультаты оценивали, используянастройки аналитического шаблона,представленного на рисунке 12. Сами результаты представлены в таблице 13.Таблица 13Результаты исследования нативных клеток SW620.

Динамика приманипуляциях с клеткамиФазы клеточного циклаS, %G1, %G2, %041,248,111,84839,945,514,47236,954,48,79641,757,31,0Из таблицы 13 видно, что в норме, с течением времени большая частьВремя инкубации, часыпопуляции клеток SW620 переходит из постсинтетической стадии клеточногоцикла в пресинтетическую (G1), при этом процент клеток в стадии S(синтетическая стадия) заметно не изменяется.87В таблице 14 представлены результаты оценки динамики измененияпроцента клеток по фазам клеточного цикла – для этого провели сравнениеклеток контрольной группы до начала культивирования с клетками,культивировавшимися в течении 48,72 и 96 часов.Таблица 14Динамика изменений фаз клеточного деления для клеток линии SW620 неподвергавшихся обработке АхВремяG1(0 часов)G2 (0 часов)S (0 часов)инкубации,Конц-ия/G1 (Х часов),/G2 (Х часов),/S (Х часов),часыАх, Мразразраз(Х часов)Концентрация Ах 0 М4801,10,81,07200,91,41,119600,811,31,0В таблице 15 представлены результаты проведенной ДНК-цитометрииконтрольных клеток (на которые не воздействовали растворами для удаленияс пластика), и клеток SW620, прокультивированных с Ах в концентрации 10‾⁴10‾⁵ и 10‾⁶М в течении 48, 72, 96 часов.Представленная таблица 15 показывает типичный пример измененияпроцента клеток, находящихся в разных стадиях клеточного цикла длявыбранной культуры клеток до и после их обработки раствором Ах.