Диссертация (Патофизиологическое значение ацетилхолина в пролиферации опухолевых клеток толстой кишки in vitro и in vivo)

1ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ЗДРАВООХРАНЕНИЯ ГОРОДАМОСКВЫ « МОСКОВСКИЙ КЛИНИЧЕСКИЙ НАУЧНО-ПРАКТИЧЕСКИЙ ЦЕНТРДЕПАРТАМЕНТА ЗДРАВООХРАНЕНИЯ ГОРОДА МОСКВЫ»ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ АВТОНОМНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕУЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ОБРАЗОВАНИЯ«РОССИЙСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ ДРУЖБЫ НАРОДОВ»На правах рукописиСмирнова Анна Вячеславна«Патофизиологическое значение ацетилхолина в пролиферацииопухолевых клеток толстой кишки in vitro и in vivo»14.03.03 - патологическая физиологиядиссертация на соискание ученой степеникандидата биологических наукНаучный руководитель:доктор медицинских наукТрубицына И.Е.Москва2017г.2ОглавлениеСписок сокращенийОбщая характеристика работыАктуальность темыРазработанность темыЦели исследованияЗадачи исследованияНаучная новизнаТеоретическая и практическая значимость работыМетодология и методы исследованияВнедрение результатовОсновные положения, выносимые на защитуСтепень достоверности полученных результатовЛичное участие автора в проведенных исследованияхАпробация работыПубликации по теме исследованияОбъем и структура диссертацииГлава 1.

Обзор литературы1. Рак толстой кишки. Современные представления о патологии57788999101010111212121314141.1.Формирование первичной опухоли толстой кишки: путьхромосомной и микросателлитной нестабильности1.2.Воспаление как фактор развития опухолевого роста1.2.1. Модели для исследования рака толстой кишки1824271.2.2. Диффузная эндокринная система толстой кишки у человека илабораторных животных (крыс)1.3. АцетилхолинГлава 2. Материалы и методы2.1.Общий дизайн исследования2.2.Эксперименты in vitro333742424232.2.1. Краткое описание клеточной линии рака толстой кишки SW620442.2.2. Методы работы с культурой клеток442.3.

Эксперименты in vivo2.3.1. Экспериментальные модели in vivo55572.3.1.1.Моделирование язвы толстой кишки572.3.1.2.Моделирование опухолей толстой кишки592.3.1.3.Моделирование язвы толстой кишки в сочетании с введениемканцерогена602.3.2.Биохимические методы и гистологическая техника602.4. Статистическая обработка результатовГлава3 Собственные результаты и обсуждение62633.1.

Биологические эффекты от воздействия ацетилхолина наопухолевые клетки SW620633.1.1. Определение рабочих концентраций раствора ацетилхолина дляin vitro исследований633.1.2. Сопоставление полученных данных и определениепролиферативной активности вещества683.1.3. Микроскопический анализ влияния ацетилхолина на характерроста популяций SW6203.1.4. Исследование концентрации EGF, ММР-3 и ММР-971763.1.5. Влияние ацетилхолина на экспрессию молекул главногокомплекса гистосовместимости человека первого и второго классов823.1.6. Влияние ацетилхолина на фазы клеточного цикла клеточнойлинии SW620843.2. Влияния ацетилхолина на рост и развитие полипов толстойкишки у крыс963.2.1. Определение рабочих концентраций раствора ацетилхолинадля in vitro исследований9743.2.2.

Патофизиологические изменения внутренних органов на фонеприменения канцерогена АОМ1093.2.3 Патофизиологические изменения внутренних органов примоделировании язвы в сочетании с введением канцерогена АОМ1153.2.4. Сравнительная оценка концентраций EGF и матриксныхметаллопротеиназ 3 и 9 типов в крови и образцах тканей вэкспериментальных моделях1203.3. Анализ причин летальности и послеоперационных осложненийпри работе с животными124Выводы127Практические рекомендации128Перспективы дальнейшей разработки темы128Библиография1295Список сокращений1АОМ1,2-азоксиметан2АхАцетилхолин3БСАБычий сывороточный альбумин V фракция4БАВБиологически-активные вещества5ВОКВосходящая ободочная кишка6ДМСОДиметилсульфоксид7ДЭСДиффузно расположенная эндокринная система8ИФАИммунно-ферментаный метод9КФКультуральный флакон10 МКАМоноклональные антитела11 МТТСолитетразолия3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолий бромида12 МТТ-методМетод по Mosmann для определения жизнеспособностиклеток.

Метаболизм тетразолия 3-(4,5-диметилтиазол-2ил)-2,5-дифенилтетразолий бромида в формазан13 НСНервная система14 ОКОпухолевые клетки15 РТКРак толстой кишки16 СКСреда культивирования17 СОСлизистая оболочка18 СлКСлепая кишка19 ТЭСТелячья эмбриональная сыворотка20 ФСБФосфатно-солевой буфер21 ЦНСЦентральная нервная система22 APUDAmine Precursor Uptake and Decarboxylation, ДЭС23 CVSОт СristallViolet Staining24 EGFЭпидермальный фактор роста25 HLAГлавный комплекс гистосовмесимости человека626 ММР-3Матриксная металлопротеиназа (протеаза) 3-его типа27 ММР-9Матриксная металлопротеиназа (протеаза) 9-его типа7Общая характеристика работыАктуальность темыРак толстой кишки (РТК) 25 лет занимает первые места в структуреопухолевых заболеваний в экономически-развитых странах (Давыдов М.И.,2011).

К этиологическим и факторам риска относят наследственнуюпредрасположенность (Корчагина, 2009), возраст, хронический стресс идлительноевоспалениеоргановжелудочно-кишечноготракта(ЖКТ),нерациональное питание (Савицкий С.Э., 2009). Биологические особенностиразвития РТК не позволяют создать полноценную программу скринига(Моисеенко, Волков, 2014, Д.Г. Заридзе, 2009) и/или создать адекватнуюисследовательскую модель для экспериментальной онкологии (Corpet DE,2003).Биологически активные вещества нейроэндокринного происхожденияобладают способностью изменять физиологические процессы, происходящиев ЖКТ.

Ацетилхолин (Ах) активно участвует в данных процессах. Вопрос егововлеченности в процесс воспаления достаточно изучен (Трубицына И.Е.,2004); (Парфенов, 2002); (Трубицына И.Е., Винокурова, 2006); (Коротько,2009), однако остается много вопросов о его влиянии на начальный этапканцерогенеза при хроническом воспалении. Слизистая оболочка ЖКТвыполняет функции диффузной эндокринной железы, относящейся к APUDсистеме. Она имеет как прямую, так и обратную связь с центральной нервнойсистемой (Воробьев А.В., 2010), и известно, что клетки этой системы –апудоциты- обеспечивают метаболизм биогенных аминов, и ацетилхолина(Ах) в частности. Благодаря Ах и его действию на эту систему происходитрегуляция секреции пептидных гормонов, которые вовлечены в начальныйэтап роста опухолевых клонов и способствуют их селекции (Blankenstein,2005)(Arias, etal, 2009).

Исследования в данной области проводятся активно сконца 90х гг ХХ века, когда было показано одновременное нейрональное игуморальное влияние Ах: прямое (через систему рецепторов клеток слизистой8оболочки кишки), и ненейрональное – через систему биологически активныхвеществ, выделяемых апудоцитами (Pelisser-Rota, etal, 2013).В 2000гг. предположили, что Ах может продуцироваться и/илинакапливаться опухолевыми клетками, которые стимулируют свой ростблагодаря его наличию в окружающих тканях (Delbro, 2012; Novotny, et al.,2011).

Установлено, что процессы нарушения гомеостаза Ах в тканях иопухолевый рост в слизистой оболочке толстой кишки (СОТК) связаны, аклетки многих клеточных линий экспрессируют рецепторы к Ах (Belo A.,2011, Pelisser-Rota, etal2013).Отсутствие полноценной экспериментальной модели, воспроизводящейопухолевый рост в слизистой оболочке толстой кишки у лабораторныхживотных (Corpet D.E., 2003) является причиной активного исследованиягенетических причин опухолей. Однако распространенность такого видаопухолей не велика, и учитывая данный факт требуется изучение спонтанного,а также связанного с воспалением опухолевого роста. Таким образом,изучение роли Ах в процессах опухолевого роста как на изолированнойсистеме (in vitro), так и в организме (in vivo) является актуальнымнаправлением для экспериментальной онкологии и патофизиологии.Разработанность темыНесмотрянаактивноеизучениемолекулярныхмеханизмоввозникновения опухолей, в том числе и рака толстой кишки (РТК), остаетсянеразработанной область нейро-иммуно-эндокринной регуляции данногопроцесса.

Вопрос о нейрональной регуляции опухолевого роста в кишечникедо сих пор изучен недостаточно подробно, что ставит задачу изучить рольацетилхолина в опухолевом ростеЦели исследованияУстановить возможные патофизиологические механизмы влиянияацетилхолина на процесс пролиферации клеток эпителия слизистой оболочкитолстой кишки in vivo и in vitro.9Задачи исследования1. На модели in vitro выявить влияние различных доз ацетилхолина наопухолевую клеточную линию клеток SW620 (рак толстой кишки человека).2. Определить in vitro концентрации ацетилхолина, которые способствуютизменению количества митозов в популяции опухолевых клеток.3. Выявитьinvitroвлияниеацетилхолинанауровеньэкспрессииповерхностных молекул главного комплекса гистосовместимости I и IIклассов опухолевых клеток.4.

Создать экспериментальные модели для изучения начальных этапов ростаопухоли толстой кишки у крыс.5. Определить изменение концентрации ацетилхолина в слизистой оболочкетолстой кишки в динамике заживления язвенного дефекта.6. Определитьвлияниеацетилхолинанаизменениеконцентрацииэпидермального фактора роста, матриксных металлопротеиназ 3 и 9 типов вэкстрактах слизистой оболочки толстой кишки у крыс.Научная новизна1.

Впервые для исследования патофизиологического значения ацетилхолина вразных модельных системах применили метод параллельного изученияфакторов межклеточного взаимодействия: эпидермального фактора роста иматриксных металлопротеиназ 3 и 9 типов.2. Впервые разработана модель опухолевого роста в толстой кишке у крыспутем индукции воспаления в сочетании с введением 1,2-азоксиметана.3. Определены факторы, влияющие на рост полипов толстой кишки у крыс сразным способом индукции первичной трансформации.4. Впервые параллельно in vitro и in vivo определено влияние ацетилхолина наконцентрацию матриксных металлопротеиназ 3 и 9 типов и эпидермальногофактора роста.Теоретическая и практическая значимость работыПоказана тесная взаимосвязь между процессом пролиферации клетоктолстой кишки крыс, как в нормальной ткани, так и на фоне воспалительного10процесса.