Диссертация (Патофизиологическое значение ацетилхолина в пролиферации опухолевых клеток толстой кишки in vitro и in vivo), страница 9

Вкачестве контроля использовали клетки в бессывороточной среде RPMI1640,которые не могут мигрировать и закрывать поврежденный участок.Результаты оценивали визуально, путем сравнения активности миграцииклеток в опыте по отношению к контролю (клетки в СК с 10% ТЭС, но без52Ах). Визуализация проводилась после окрашивания по Лейшману. Принеобходимости планшеты хранили в темном месте в закрытой коробке втечении 6 месяцев, после чего утилизировали. Для фото-документациииспользовалифотоаппаратиинвертированныймикроскопNikonсувеличением х10 и х40.Для уточнения эффектов от Ах на клетки линии SW620 проводилиисследование клеточного цикла методом проточной цитофлуориметрии.Исследование занимало 6 дней. Целью было создание шаблона для сравненияи качественный анализ изменений фаз клеточного деления.В день проведения CVS-исследования, параллельно, оставшиеся клеткипереносили в новый КФ в количестве 105 кл/25 см2 в 3 мл СК.

Через 24 часавносили Ах (до конечных концентраций 10-4М, 10-5М, 10-6М) и инкубировали48, 72 и 96 часов. После окончания инкубации в КФ СК с препаратомзаменяли на свежую СК с 0,1% содержанием ТЭС. Перед началом работыготовили фосфатносолевой буфер (ФСБ) на деионизированной воде, которыйиспользовали ex tempore. Для детекции фаз клеточного цикла клетки удаляли сподложкирастворомВерсена(ПанЭко,РФ),центрифугировалипри1500 об/мин 7 минут дважды в 7 мл ФСБ с 0,1% содержанием альбумина набакетной центрифуге BioScan (США); затем дважды отмывали в чистом ФСБи добавляли реактив для определения фаз клеточного цикла DNA QC(Invitrogen, США) согласно инструкции.

Для снижения агрегационнойактивности клетки инкубировали 15 минут в темном месте во льду, после чегосразудетектировалирезультатынапроточномцитофлуоримтреBDFacsCantoTMII (BDBioscience, США).В каждом образце анализировали не менее 50 000 событий, детекциюпроводили в каналах FL1 (эмиссия 515-545 нм) и FL2 (эмиссия 563-607 нм).Данные фиксировали в логарифмическом шкале для обоих каналов.ОбработкуполученныхпрограммногоданныхобеспеченияпроводилицитометрасMathFitпомощьювнутреннего(BDBioscience,США).Использовали следующие виды контролей: (1) клетки рутинного содержания,53(2) клетки, пересаженные в новый КФ, но не обработанные Ах, (3) клетки,обработанные колмицидом по описанному выше протоколу (содержалитолько клетки в S0-фазе). Детектировали фазы S0, G1, G2 с учетоминтенсивности флюоресцентной метки и распределения клеточной популяции.После получения данных цитометрии, оставшиеся в СО2-инкубаторе КФс неокрашенными клетки использовали для дальнейшей работы. ИФАметодом в супернатантах и в клетках определяли концентрации EGF, MMP-3,MMP-9.ММР-3иММР-9вбиоматериалеопределяливформатекоммерческого набора Quantikine ELISA (R&D Systems, США, кат.

№ DMP300и DMP9000, соответственно); для определения EGF наборы Invitrogen (LifeTechnology, США, кат № KHG0061). Для анализа использовали средниепорции клеток и лизатов, полученные из 3 КФ.Для сбора супернатанта с целью дальнейшего определения количестваEGF,ММР-3и9использовалиусредненныепробыизфлаконовкультивирования (не менее 3 флаконов для одного эксперимента).

Для этогопосле окончания инкубации жидкую фракцию отбирали в маркированныепробирки,центрифуировали5 минутпри1000 об/мин,послечегонадосадочную жидкость переносили по 1 мл в маркированные микропробиркии хранили при -700С до шести месяцев. Для исследования этих же показателейвнутри клетки использовали клетки из КФ. Их удаляли с подложки, осаждалицентрифугированием, осадок подсчитанных клеток разводили в ФСБ, послечего аликвотили в маркированные микропробирки по 2х10 6 клеток в 500 мкл,и однократно центрифугировали для осаждения при 1500 об/мин 7 мин.Супернатант выливали, клетки замораживали при -70°С.Замороженные осадкиклеток размораживали при +4°С в холодильной камере, после чегополученный клеточный лизат разводили до необходимой концентрации (дляEGF – 1х106кл/мл, для MMP-3 и ММР-9 – 2х106кл/мл) в холодным ФСБ.

Дляудаления клеточных стенок проводили центрифугирование при 13000 об/мин7 мин на микроцентрифуге MicroSpin (Biosan, Латвия). Надосадочнуюжидкость переносили в маркированные пробирки, осадок утилизировали. Все54дальнейшие манипуляции по проведению ИФА-исследования проводилисогласно рекомендациям производителя. Результат реакции определяли наплашечном ридере «Пикон» при длине волны 540 нм.Учитывая способность Ах гидролизоваться с образованием холина,было важным установить возможность влияния этого фактора на изменениеколичества наиболее стабильных поверхностных маркеров – комплековгистосовместимости IопределениеуровнягистосовместимостииII классов.

С этой целью было проведеноэкспрессиипервогоимолекулвторогоклассовглавногокомплексаметодомпроточнойцитометрии. Подготовка клеток к исследованию проводилась параллельно среакцией «заживление раны». Буферные растворы для работы изготавливалисамостоятельно, используя методы разведения, используя деионизированнуюводу и 10%формалин для молекулярных исследований (Sigma-Aldrich, США).Окрашивание моноклональными антителами (МКА) и детекция материалапроводилась после пробоподготовки. Процедуру проводили через 72 и 96часов после однократного введения Ах в дозе 0,33*10-4М, 0,33*10-5М, и0,33*10-6М. Для этого клетки удаляли с подложки, разводили до концентрации0,35х106кл/мл СК, и 2990 мкл клеточной взвеси помещали осаждаться напластик 6-и луночного планшета (Corning, США); после чего добавлялираствор Ах.

Сбор клеток осуществляли с 3 лунок одного планшета,усредненнуюпорциюокрашивали.Всегопроведено7независимыхэкспериментов.Окрашивание МКА Serotec (CША) проводили после окончанияинкубации и удаления клеток с пластика с последующей трехкратнойотмывкой в ФСБ от остатков белка из среды кульивирования. МКАиспользовали в количестве 10 мкл/1млн.клеток. Клоны МКА:MCA 2590Fitc(HLAI) и MCA1879PE (фикоэритрин) (HLAII).

Инкубация занимала 30 минут,в условиях холодильника, после чего клетки осаждали и дважды отмывали отнесвязавшихся антител.55Окрашенный материал фиксировали в 300 мкл 1% раствора формалина.УчетрезультатовреакциипроводилинапроточномцитометреBDFacsCantoTMII. В каждом образце анализировали не менее 104событий,детекцию проводили в каналах FL1 (515-545 нм) и FL2 (563-607 нм). Данныепредставляли в логарифмической шкале для обоих каналов.2.3. Эксперимент in vivoЭксперименты осуществляли в соответствии с Приказом №7 МинздраваСССР12.08.1977г.организационных«Оформмерахработыпосдальнейшемусовершенствованиюиспользованиемэкспериментальныхживотных». Белые лабораторные крысы линии Wistar закупались в питомнике«Пущино» (РФ); и содержались в помещении экспериментальной клиники прилабораториипатофизиологииЦНИИГ(далееМКНЦ)доначалаэкспериментальной работы.

Доступ к воде и кормление ad libitum; кормгранулированный, стандартного состава («Чара», ЗАО «Ассортимент-Агро»,РФ). Перед исследованием животных делили на 4 группы.Для уточнения значимости Ах в опухолевом росте, нами быларазработана схема проведения эксперимента на животных, состоявшее из двухэтапов. Первый, подготовительный этап включал в себя две части: отработкаметодовхирургическогомоделирования,ивторая – использованиеканцерогена 1,2-азоксиметана (АОМ).

После отработки хирургической иканцерогенноймоделиприступаликразработкенепосредственноэкспериментальной части: исследования сочетанного действия воспаления иацетилхолина с введением АОМ. Определение стадий воспаления иопределение динамики изменения концентрации Ах проводили на первомэтапеподготовительнойработы,апатологоанатомическуюиморфологическую верификацию полученных результатов – на всех этапах.ИФА-исследований концентрации ММР-3, 9 и EGF проводили на этапеработы с канцерогеном, после утверждения окончательного варианта56оперативного моделирования и собственно эксперимента.

Схема проведенияработы приведена на Рисунке 7.Рисунок 7 Дизайн исследования эффектов in vivoНа подготовительном первом этапе определяли оптимальные методыиммобилизации и анестезии животного, выбирали методы оперативногодоступа,характеристикиаппликационнойсистемы,времяэкспозициикислоты, а также уточняли воспроизводимость ранее полученных результатов.Методом хронометрии было установлено, что оптимальная длительностьоперации составляет 23 минуты, а внутримышечное введение медикаментовдля общей анестезии необходимо проводить за 15-22 минуты до началапроведения асептической обработки кожи животного. Наступление стадииглубокого наркоза варьировало у животных одной и той же группы и зависелоот телосложения.