Диссертация (Патофизиологическое значение ацетилхолина в пролиферации опухолевых клеток толстой кишки in vitro и in vivo), страница 13

Микрофотографии монослоя. А.Контроль после 24 часов инкубации.Б.Контроль после 96 часов инкубации В. Ах 10-5 М, 24 часа инкубации. Г. Ах10-5 М 96 часов инкубации.Мы считаем, что изменение характера роста клеточной линии SW620 вответ на действие Ах in vitro может быть связано с наличием белка p53,функциональная связь которого с Ах была показана ранее в работах Cheng иRaufman 2005-2008 гг. [60; 147] и Ritzenthaler 2009 года [170]. Известно, чтоактивация белка р53 происходит в ответ на многочисленные стрессовыестимулы, в частности в ответ на повышение концентрации монооксида азота.При воздействии Ах концентрация монооксида азота возраствает, чтоприводит к вторичному отбору наиболее жизнеспособных клонов ОК, вкоторыхутраченачувствительностькпро-апоптотическомусигналу76опосредованному белком р53 [81; 195].

Увеличение концентрации белка р53 вбыстро пролиферирующих клетках, по сравнению с делящимися медленноклетками, было описано ранее [3].Биологическое значение увеличения концентрации р53 в данном случаев том, что клетки, которые быстро реплицируют ДНК, более подверженывозникновениюповрежденийгенетическогоаппарата,чем,например,неделящиеся клетки в фазе G0. Следовательно, увеличение концентрациир53 — подготовка клетки для быстрой реакции на возможное возникновениеповреждений ДНК. Очевидно, что для остановки клеточного цикла в условияхстимуляции пролиферации внеклеточными ростовыми факторами (напримерфакторамироста,гистогормонамиит.д.)требуетсяболеевысокаяконцентрация р53, чем в условиях фазы G0. В связи с тем, что результатомпередачи пролиферативного сигнала является одновременно активацияпротоонкогенов, и, инактивация р53, было предположено, что активный ростклеток SW620 после обработки Ах связан с тем, что антиапоптотическоедействие ростовых факторов, реализуется уже после апоптотическоговоздействия р53 на популяцю.

Таким образом остаются только те клетки,которые не погибли через р53-опосредованный путь кдеточной гибели. Вокругэтихклетокпроисходтразрастаниепопуляциидочернихклоновиклоновиформируется зона измененного характера роста - бляшка.3.1.4. Исследование концентрации EGF, ММР-3 и ММР-9Взаимосвязьскоростиростапервичныхопухолевыхсостоянием окружающих тканей определяется системой стимулирующих рости трансформирующих состояние факторов внеклеточного матрикса - факторовроста и матриксных металлопротеиназ [87; 119].

Связь между количеством ипрофилем фактров роста в межклеточном пространстве и количеством ипрофилем матриксных металлопротеиназ (матриксинов) в настоящий моментактивно изучается [81; 114; 152; 153; 172; 192]. Выбранные для исследованияАх in vitro ОК были способны к синтезу и экспрессии факторов роста77(эпидермального фактор роста или EGF) и матрикс-разрушающих белков(матриксинов 3 и 9 типа или MMP-3 MMP-9). Нам необходимо было уточнить,степеньихвовлеченностивпроцессростаопухолевыхклетоквизолированных условиях.

Для этого количественно было определеносодержания эпеидермального фактора роста - EGF, и матриксинов - ММР-3,ММР-9 в среде культивирования и в клеточном лизате, который получали изклеток после культивирования с различными концентрациями Ах различноевремя - 72 и 96 часов инкубации с Ах. Сроки отбора материала былиобусловлены тем, что первое деление клеток, и, следовательно наиболееактивный синтез приходится на 32-48 час, что было показано ранее.

Внастоящее время, показана взаимосвязь между накоплением Ах в зонахпервичнойопухолевойтрансформацииисверхэкспресииматриксныхметаллопротеиназ 2, 3 и 9-ого типов [44; 60; 131]. Учитывая тесную связьмежду формированием межклеточных контактов и вовлеченностью в этотпроцесс системы EGF-EGFR, необходимо изучение и уточнение механизмовэтого процесса [35].Способность Ах стимулировать продукцию EGF в опухолевой ткани досих пор изучена недостаточно.

Лимитирующим фактором исследователиназывают наличие на мембранах опухолевых клеток некоторых типоврецепторов, в частности nα7AcH [36; 44; 66; 81; 157; 164]. Однако, по даннымDelbro (2012) Ах не всегда нуждается в этих специфических рецепторах иможет реализовывать свои эффекты иными механизмами [75].Утверждение, что Ах является стимулятором синтеза EGFопухолевымиклетками проверено методом ИФА на клетках линии SW620. Установлено, чтоклетки этой линии, через 72 часа инкубации без добавления Ах секретируют всреду 2,7±0,9 нг/мл EGF, в то время как интрацеллюлярно определяется13,9±4,8 нг/мл белка (см.

Таблица 9). При исследовании концентрации EGF вСК через 72 часа после добавления разных концентраций Ах самое низкоесодержание белка: наблюдали при культивировании с 10 -4М Ах. В случаекультивирования клеток с Ах в концентрации 10-5 и 10-6М количество EGF78возрастало. Таким образом выход EGF в среду культивирования носилдозозависимый характер и увеличивался обратно пропорционально дозе Ах, скоторым инкубировали клетки.Таблица 9Концентрация эпидермального фактора роста в среде культивирования иклеточном лизате после инкубации клеток с Ах в течение 72 часовКонцентрация EGF, нг/млКон.

концентрацияАх при инкубации,Среда культивирования, n=12Лизат клеток, n=9ММеmin; maxМеmin; max02,71,8; 3,613,99,1; 18,710-41,80,9; 2,76,82,6; 11,010-53,42,7; 4,114,54,2; 24,210-63,83,0; 4,621,410,6; 32,2К 72-ому часу инкубации с Ах, происходило накопление EGF внутриклеток. Выявленная закономерность носила статистически недостоверныйдозозависимый характер: чем ниже доза, тем больше EGF находилось внутриклеток. Установленная тенденция к накоплению EGF внутри клеток к 72 часупри совместной инкубации клеток с Ах требует более тщательного изучения.Полученные результаты согласуются с экспериментальными данными,которые указывают на тесную взаимосвязь скорости регенерации тканей иконцентрации Ах в зоне первичной альтерации [71; 165], где происходитрезкое увеличение концентрации факторов роста и рецепторов к ним.

Приувеличении концентраци Ах в зоне повреждения происходит стимуляция NOсинтетазы, что снижает гипоксемию тканей и имеет физиологический смыслпри остром повреждении, однако именно в этих условиях Ах можетактивировать синтез рецепторов к факторам роста. Это свойство Ах вызываетпролиферациинетольконормальных,ноиопухолевыхклеток[75; 135; 156; 157; 163; 165].

С другой стороны, в тканях повышенноесодержание Ах вызывает накопление оксида азота, что стимулирует митоз79через систему EGF и может влиять на синтез белков межклеточного матрикса[35; 71]. Отсутствие возможности дальнейшего моделирования этих процессовосложняет процессы изучения этих явлений, и требует дальнейшего изучения.Матриксные металлопротеиназы 3 и 9-ого типов являются наиболееинтересными объектами изучения ввиду их активного взаимодействия смежклеточном субстратом на этапе формирования первичной опухоли[65; 78; 101]. В частности, ММР-3 рассматривают как возможный маркерранней трансформации клеток полипов в злокачественную опухоль, а ММР-9активно изучают в качестве прогностического маркера инициации раннегометастазирования при РТК проксимальных отделов [93; 152; 154; 180].

Впоследние10 летбылиполученыданныеоналичиисвязимеждуконцентрацией Ах в зонах хронического воспаления и состава матриксинов[65; 74; 101]. При изучении влияния Ах как агента, влияющего на процесспролиферации, и, следовательно, фактора, регулирующего формированиемежклеточных контактов, были получены данные, представленные в таблице10.Из таблицы 10 видно, что при культивировании в течении 72 часовММР-3 в группе контроля не определялась, точно также, как и в случаеклеток, проинкубированных с Ах в концентрации 10¯⁴ М. При добавлениидругих концентраций Ах наблюдали увеличение концентрации ММР-3: приинкубации клеток в течении 96 часов с 10‾³М Ах количество ММР-3недостоверно увеличивалось. Такого эффекта для других доз Ах ненаблюдали, что можно объяснить только особенностями метаболизма даннойклеточной линии.

При определении концентрации ММР-3 в клеточном лизатеобнаружены следующие закономерности: в группе контроля количестводанного вещества повышалось, в то время как при добавлении Ах имеласьтенденция к снижению их концентрации.80Таблица 10Количество ММР-3 и ММР-9 в разных биологических субстратах через 72 и96 часов инкубации с АхКонцентрация матриксных металлопротеиназ, нг/млСреда культивированияКон.конц-ияАх, МММР-372 часа, n=9ММР-996 часов, n=9Ме(25;75)%Ме(25;75)%000; 02,7*10-400; 010-56,610-619,072 часа, n=996 часов, n=12Ме (25;75)%Ме(25;75)%2,3;3,70,10,02;0,10,0◊0; 03,33,3;6,10,00,0; 0,100; 00; 11,414,1#5,3;12,20,00,0; 0,00,040,0; 0,16,1;20,03,33,3;6,70,140,0; 0,51,50,2; 1,7Концентрация матриксных металлопротеиназ клеточного лизата, нг/млММР-3Кон.конц-ия72 часа, n=9ММР-996 часов, n=972 часа, n=1296 часов, n=12Ах, ММе(25;75)%Ме(25;75) %Ме00,10,1; 0,145,75,3; 54,80,50,3; 1,20,90,8; 1,110-443,013,5;49,631,225,3;35,50,40,3; 0,91,360,9; 1,910-524,612,7;25,316,814,8;16,90,90,0; 0,90,10,01;0,310-625,718,2;31,214,19,4;39,00,30,1; 0,51,20,8; 1,4(25;75)% Ме(25;75)%*статистически значимое увеличение концентрации ММР-3 при сравнении группы контроля для 72и 96 часов инкубации клеток р=0,02 (Минн-Уитни тест)◊статистически значимое увеличение концентрации ММР-9 при сравнении группы контроля для 72и 96 часов инкубации клеток р=0,03 (Минн-Уитни тест)#статистически значимое увеличение концентрации ММР-3 при сравнении группы Ах10-5М через72 и 96 часов инкубации клеток р=0,03р=0,03 (Минн-Уитни тест)81Концентрацию ММР-9 в среде культивирования через 72 и 96 часовинкубации клеток с Ах детектировали на пределах чувствительности метода,однако внутриклеточная концентрация данного вещества была достаточновысокой.