Диссертация (Патофизиологическое значение ацетилхолина в пролиферации опухолевых клеток толстой кишки in vitro и in vivo), страница 8

Ко второй группе исследований относятся цитометрическиеисследованияклеток,актретьей–ИФА-определениесекрецииэпидермального фактора роста, матриксных металлопротеиназ 3-его и 9-оготипов.Оценка скорости удвоения клеток, скорости образования колоний,формирования монослоя использовали по методике, описанной в руководствеР.Я. Фрешни (2012). В стерильные пластиковые чашки Петри диаметром 10 смпомещали по 2х105 клеток в СК и обрабатывали их Ах в различныхконцентрациях и с разным временем экспонирования. После окончанияинкубации с препаратом среду удаляли, вносили новую СК без препарата икультивировалив течение необходимого времени с ежедневным подсчетомколичества дочерних клеток под инвертированным микроскопом (определениескоростиудвоения).Дляопределенияскоростиколониеобразованияиспользовали модификацию метода: общее время инкубации составляло48240 часов, колониями считали образования, содержащие более 30 клеток.Также скорость удвоения популяции оценивали по Гольдману путемсравнения количества клеток в разных экспериментальных точках.Исследование пролиферативной активности in vitro методом МТТ проводилина 3-5 пассаже и дополнительно использовали следующие реактивы:a)Буферный раствор для приготовления раствора ацетилхолина (Ах).

Вкачестве буферного раствора использовали среду RPMI1640 с добавлениемстерильного раствора HEPES до конечной концентрации 0,1 мМ;b)Стоковый (концентрированный) раствор Ах. Для приготовленияраствора на аналитических весах взвешивали сухой реактив Ах (Украина) имедленно растворялив буферном растворе. Полученныйконцентратфильтровали через одноразовую фильтровальную систему NalgeneTM (США) встерильную пробирку 5 мл. Раствор использовали в этот же день.c)Реактив МТТ (ПанЭко, РФ) в концентрации 5мг/мл, стерильный,который готовили из сухой производственной навески по приложеннойинструкции.Для оценки влияния Ах на жизнеспособность и изменение скоростипролиферацииклеточнойлинииSW620использовалиметодМТТ,адаптрованный Э.Ш.

Соломко (2011) и А.Н. Иншаковым (2012) по Mosmann,(1983). Продукт реакции реактива МТТ и митохондриальных эстераз прирастворении образует окрашенный раствор, оптическую плотность которогоможно оценить при длине волны 490-540 нм [162]. Интенсивность окраскираствора прямо пропорциональна количеству живых клеток в суспензии [63].Метод имеет ограничения применения, так как исходно был разработан дляклеток крови [127] и лишь впоследствии адаптирован для адгезивных культур(работа с ними предполагает использование детергентов: раствор ЭДТА илиферменты с протеиназной активностью), которые влияют на активностьмитохондриальных НАД(Ф)-зависимых интрацеллюлярных оксиредуктаз ивнемитохондриального НАД(Ф), количество которых может различаться из-запроцессов обработки культуры)[56; 80; 125].

Для интерпретации результатов49используют как парное сравнение (по принципу «доза1 vs доза 2», так ипроводятнезависимыесравнения–дляуточнениядинамическихзависимостей: «дата 1 vs дата 2»).Для предотвращения гидролиза Ах в водных растворах рабочиереактивы готовили ex tempore методом серийных разведений из стокового10М до конечных концентраций в лунке 0,25М; 0,125М; 0,0625М; 0,03М;0,015М; 0,008; 0,004М; 0,002М; 0,001М, 0,001М; 0,0001М и 0,000001М; pHрабочих растворов Ах составлял 7,2-7,4.МТТ-метод. В зависимости от времени инкубации (24, 48, 72 или 96 часов).Для этого клетки в количестве 4х10³, 3х10³, 2,5х10³, или 2х10³ штуксоответственно, в объеме 190 мкл, помещали в лунки 96-и луночногоплоскодонного планшета.

Инкубировали 24 часа для адаптации клеток последействия детергентов, после чего в необходимых количествах вносили Ах.Использовали три типа контрольных точек: (1) клетки без препаратов; (2)чистая бессывороточная среда RPMI-1640 и (3) чистая СК. Результаты тестаопределяли через 24, 72 и 96 часов культивирования с Ах. После окончанияинкубации в каждую лунку добавляли по 10 мкл стокового (5 мг/мл) раствораМТТ и инкубировали в течение 3 часов, после чего удаляли надосадочнуюжидкость,идобавляли200 мклДМСО.Растворперемешивалииинкубировали 10 мин при 37°С, после чего определяли оптическую плотностьсреды на анализаторе иммуноферментных реакций «Униплан» («Пикон», РФ)при 490 нм, используя ДМСО как нулевой контроль.

Интенсивность окраскираствора в лунках прямо пропорциональна числу живых клеток.Процент живых клеток вычисляли по формуле:СЗОП(опл)– среднее значение оптической плотности триплета в опытном образцеСЗОП(пл)- среднее значение оптической плотности триплета в лунках со средой, но без препаратаСЗОП(кл)- среднее значение оптической плотности триплета в лунках с нативными клетками.Для определения относительного количества клеток, находящихся вмитозе, дополнительно с МТТ-методом было проведено коллориметрическое50определениеотносительногоинтернализацииколичествакристалл-виолетаделящихся(CVS).Таккакклетокметодомреактивспособенсвязывается с рибозами клеток, и, в митотически активной популяции этотпроцессидетактивно,альтернативу/дополнениеданныйметодуспособМТТ,оценкиеслирекомендуютнеобходимокакисключитьвероятность усиления клеточного дыхания под действием препарата (что мынаблюдали в лунках с конечной концентраций 10-4-10-6М), и/или возникаютзатруднения в интерпретации результатов МТТ или аналогичных методов[80; 99; 100].

Косвенным ограничением данного метода является наличие вклеткахактивногоанаэробногогликолизаиинтенсивноевыделениенекоторых метаболитов [56; 63; 80; 99; 100]. В условиях стаза клетка начинаетсамостимуляцию роста за счет накопленных питательных веществ и/илиростовых факторов [35; 80; 99]. В результате сравнения этих двух группвозможно определить – обладает вещество истинным анти/пролиферативнымдействием или является стимулятором дыхания и/или синтеза каких-торостовых компонентов.Для исследования клетки, помещали в лунки 96-и или 48-и луночногоплоскодонного планшета. До внесения Ах клетки преинкубировали 24 часа,после чего вносили Ах в необходимых концентрациях и инкубировали 48, 72,96 часов в соответствии со схемой эксперимента. По окончании инкубациизаменяли СК на свежую, содержащую 10% или 1% ТЭС.

Использовалиследующие типы контролей: (1) клетки без препаратов; (2) клетки срастворителями (спирт и фосфатно-солевым буфером); (3) чистая СК.В лунки 96-луночного плоскодонного планшета вносили взвесь клетокобъемом 180-200 мкл (концентрация для 96 часов инкубации -3,7х104 кл/мл,для 72 часов -4,5х104 кл/мл и для 48 часов – 2 х104 кл/мл) и 10 мкл препаратадо конечных концентраций 10-4, 10-5 и 10-6 М. После окончания инкубациипланшеты центрифугировали 5 минут при 1500 об/мин на центрифуге дляпланшетов BioScan, затем удаляли СК, фиксировали в 100 мкл 1% раствораформалина (рН 7,2-7,4) в течение 30 минут при комнатной температуре.51Формалин удаляли, обсушивали лунки на воздухе, вносили раствор красителяпо 100 мкл/лунка и инкубировали 10 минут. Краситель собирали пипеткойдосуха, после чего клетки тщательно промывали дистиллированной водой дополногообесцвечиванияпромывочногораствора.Остаткижидкостивысушивали на воздухе до полного испарения, после чего в каждую лункувносили 200 мкл 95% этилового спирта, и 40 минут инкубировали втермошейкере BioScan (США) при 400 об/мин (+370С).

После растворениякристаллов проводили измерение оптической плотности при длине волны615 нм на спектрофотометреThermo (США). Процент живых клетокоценивали аналогично тому, как описано в разделе метод МТТ.В дальнейшем, определяли эффекты низких доз Ах на способностьклеток мигрировать и затягивать повреждения монослоя. Для этогоиспользовали тест «заживления раны» или Scratch-test [94] (модификацияЭ.Ш. Соломко).

В нашем исследовании мы использовали его для анализаэффектов Ах, внесенного в среду культивирования в дозах, которые невызывали цитотоксического эффекта. Для этого дополнительно использовалипротокол «Приготовление раствора эозина метиленового синего типаЛейшмана» (ПанЭко, РФ): концентрат красителя разводили в 3-4 раза в PBS(pН 6,4-7,0)согласно рекомендациям производителя.Конечные концентрации Ах в лунках составили 10-4М, 10-5М, и 10-6М.Для исследования клетки помещали в 6-и луночные планшеты (Corning, США)по 2х105 клеток/лунка, и инкубировали в 3 мл СК 24 часа, после чегодобавляли препарат в необходимых концентрациях и оставляли на 24, 48, 72,96 часов. После образования монослоя в контрольных лунках, целостностьслоя клеток во всех лунках нарушали путем соскабливания части клетоккончиком наконечника от дозатора на 1000 мкл (Biohit, Финляндия).