Диссертация (Патофизиологическое значение ацетилхолина в пролиферации опухолевых клеток толстой кишки in vitro и in vivo), страница 12

Сравнительный анализ данных и определение пролиферативнойактивности веществаДля проведения исследования клетки контрольные и с Ах параллельноинкубировали согласно результатов скорости удвоения 48, 72 и 96 часов.После чего среду удаляли из лунок и заменяли на СК с 1/10 % ТЭС. Былоустановлено, что действие Ах на клетки SW620 зависит от концентрациисыворотки: т.е. питательных компонентов и ростовых факторов, времениинкубации и количества Ах в растворе.

Данные представлены таблице 7.Таблица 7Исследование пролиферативной активности клеток SW620 методом CVS,после инкубации с не цитотоксичными концентрациями Ах и сравнениеполученных данных по группамДлительность инкубации с Ах, часыАх, %ТЭС96 (n=9/9)48 (n=9/9)72 (n=15/9)М в СК(25;75)%Ме %(25;75)% Ме % (25;75)%Ме %100,0/100,0100,0 100,0/100,0 100,0 100,0/100,0100,0073,1/99,693,879,8/111,279,265,4/100,088,010-410%72,0/101,0-584,271,9/117,9 113,1 80,9/120,991,91085,9*/** 82,0/88,6 102,9* 79,8/105,4 113,7*/** 86,4/129,310-6100,0/100,0100,0 100,0/100,0 100,0 100,0/100,0100,0045,9/95,655,8/62,378,461,5/117,858,159,8◊10-41%76,6/97,5-593,0/101,7 112,3 98,5/122,088,295,4◊1091,8/137,7108,9105,7◊ 80,2/114,9 116,4 91,7/125,010-6* р=0,01 статистически значимое изменение количества пролиферирующих клеток(Kruskal-Wallis test)** р=0,01 статистически значимое увеличение количества пролиферирующих клеток к 96ому часу (Kruskal-Wallis test)◊ р=0,002 статистически значимое изменение количества пролиферирующих клеток взависимости от наличия сыворотки в среде (Mann-Whitney-test)69Статистически значимых различий между групп проинкубированнымипри 1% и при 10% с ТЭС в среде после 48 часов нами найдено не было.Результаты сравнения при 48-и часах инкубации мы склонны расценивать какартефакты, однако это требует более детального изучения, так какмаксимальная скорость гидролиза Ах приходится на первые часы, а первоеделение клеток таким образом попадает на период между 30 и 48-ым часом.Так как для 72 и 96-и часов инкубации этих различий нами обнаруженоне было, это позволило провести сравнение эффективности культивированияклеток только при 10% содержании ТЭС.

При анализе данных былообнаружено,чтоувеличениепроцентапролиферирующихОКприконцентрации Ах 10-6М имеет динамическую характеристику (увеличениечисла пролиферирующих клеток), и имеет статистически значимые изменения(Kruskal-Wallis test: p = 0,01). При сравнении значений оптической плотностирастворов в группах проинкубированных с Ах в концентрациях 10-6 М быловыявлено статистически значимое различие между группами: p = 0,01.

Присравнении групп с длительностью инкубации 72 и 96 часов таких различийобнаружено не было.Такимобразомвозникланеобходимостьдальнейшегоизученияэффектов от кратковременного присутствия Ах в СК ОК так как присопоставленииполученныхданныхсрезультатамиметодаподсчетаколичества удвоений и образования колоний, описанных ранее, установленосовпадениерезультатовтолькодлявременнойточки72 часа,чтосоответствовало второму-третьему делению клеток при инкубации ОК с Ах вконечной концентрации 10-4 -10-6М.УчитываявыявленнуюМТТ-методомтенденциюкувеличениюпролиферативной активности для доз Ах 10-4-10-5М, которая не былаподтверждена дополнительными методами, было выдвинуто предположение,чтонаиболеенарушенныйвероятнойпластическогопричинойитакогонесоответствияэлекторолитногоявляется(предположительнокальциевый) обмена клеток в ответ на действие Ах, которое нашло70подтверждение в литературе [60].

Также нельзя было исключить стимуляциюроста опухолевой линии SW620 в ответ на обработку Ах через системуматриксных металлопротеиназ и фактра роста эпителия [65]. Данныепроведенного анализа показаны в таблице 8.Таблица 8Сопоставление эффектов, детектированных методом МТТ и с использованиемкристалл-виолета, на популяцию после обработки АхДеление клеток при сравнении метода оценки жизнеспособностиМТТи метода с кристалл виолетомАх, МI (24-48 часов)10-410-510-6II-III (48-72 часа)III-IV (72-98 часов)НедостоверноеДостоверноеНедостоверноеувеличение / нетснижение / достове снижение / нетэффектарное снижениеэффектаНедостоверноеНедостоверноеНедостоверноеувеличение / нетснижение / нетснижение / нетэффектаэффектаэффектадостоверноедостоверноедостоверноеувеличение / достоверувеличение / достоснижение / достоверное снижениеверное увеличениеное увеличениеПолученные данные согласуются с выводами о том, что действие Ахноситузконаправленныйхарактер.Скудныеданныелитературыоцитотоксическом эффекте раствора Ах не позволяют решить вопрос о том,какой именно эффект мы наблюдали – стаза клеточной культуры илиизменение длительности фаз клеточного цикла при использовании низкихконцентраций.713.1.3.

Микроскопический анализ влияния ацетилхолина на характерроста популяций SW620 характера роста популяции клеток SW620Для того, чтобы дать ответ о влиянии Ах на скорость пролиферацииопухолевых клеток линии SW620 необходимо было ответить на следующиевопросы: (1) как изменяется характер роста слоя клеток, (2) могут ли клеткимигрировать, (3) как меняются концентрации факторов роста и межклеточныхконтактов в среде культивирования и в самом клеточном лизате. Учитываяпредставленные ранее данные, и характеристику выбранной опухолевоймодели можно предположить что существует взаимосвязь между ростомклеточной популяции после кратковременной обработки Ах и тем, какиефакторы роста и матриксины она продуцирует.Предпосылками для проведения этих исследований послужили идеи,высказанные в работах [47; 81; 119; 131; 136; 159], в которых обсуждаютсясвязи между активностью факторов роста и наличия избыточного количествако-стимулирующих факторов различной природы в области воспаления.УчитываядвойственнуюприродудействияАх[44; 146; 147]–какнейромедиатора и как гистогормона – мы провели качественную оценккуспособности клеток к миграции (Scrach-test) и количественно определиликонцентрацию фактора роста эпителия (EGF), а также количетсва матриксныхметаллоппротеиназ третьего (MMP-3) и девятого (MMP-9) типов в средекультивирования иммуно-ферментым методом.Микроскопия клеток необработанных и обработанных Ах в течение72 часов в конечной концентрации 10-4 - 10-6М, позволила определитьхарактер роста монолоя.

В группе контроля клетки покрывали 65-70%площади дна флакона, рост их был равномерым, без зон многослойного роста,в то время как в сравниваемой группе он изменялся - образовывалась такназываемая «культуральная бляшка» или «шапочка» - шарообразная колонияклеток, слабоприкрепленная к пластику. Эта колония клеток имеласпособность легко открепляться с подложки, далее мигрировать в толще72среды, и, оседая на дно образовывать новые локусы роста. Результатыисследования представлены на рисунке 9. Аналогичный эффект мынаблюдали и при проведении Scrach-test.АБРисунок 9 А.

Вид клеток до обработки Ах 24 часа инкубации, увеличение х40Б. Вид этих же клеток через 72 часа инкубации после обработки Ах в дозе0,0001М, увеличение х40Оценка результатов метода носит качественный характер, что являетсяего ограничением для количественной оценки эффектов от препарата [94]. Темне менее, это помогает оценить наличие клеточного движения, егонаправленность и скорость заживления деффекта. Метод позволяет собиратьдостаточный объем образцов для исследования – для количественногоопределения матриксных металлопротеиназ [74; 159], факторов роста и тд[60]. Мы использовали модификацию данного метода, предложенную в работеСоломко, (2011), с праллельным измерением концентраций матриксныхметаллопротеиназ и фактора роста эпителия.Данные представлены нарисунке 10.Установлено, что Ах влияет на скорость роста культуры ОК ТК SW620,и обладает слабым времяопосредованым эффектом на формированиеклеточныхструктурсплотнымимежклеточнымимонослойной выстилки дна культурального флакона (КФ).контактамитипа7372 часа сАхУвеличение Х20Увеличение Х400МАх 10-6 МАх 10-4МРисунок 10 Скратч-тест.

Фотографии состояния монослоя после егоразрушения и внесения Ах, 72часа инкубации, увеличение х20 и х40Вероятнее всего, Ах формирует предпосылки к более раннемупрохождению стадий клеточного цикла. При использовании Ах в течение 24,48, 72 и 96 часов в конечных концентрациях 10-4-10-6 М были установленыизмененияхарактераростакультуры:наднеКФобразовывалисьмногослойные зоны роста клеткок, которые окрашивались в более темныйцвет, и мешали оценке скорости миграции. При исследовании способностиклеток к миграции описанным методом была установлена тенденция к болееактивному зарастанию дефекта в группах, где был использован Ах. При этомговорить о достоверно более активной миграции мы не можем – клетки не74«наползают на рану», а открепляются и занимают свободное пространствоблагодаря описанным выше активным центрам деления.

К 72-ому и 96-омучасу инкубации в группах, обработанных Ах выявляется наиболее выраженнаятенденция к образованию шарообразных колоний.Визуальное исследование этих зон при микроскопии позволилопредположить, что бляшки являются наиболее активными центрами деленияклеток - они способны длительно нарастать на слое, затем открепляться отнего, перемещаться в СК и при оседании на дно образовывать новыепролиферирующие колонии. Для подтверждения этого предположенияпровели два типа окраски: по Лейшману, и с 0,04% раствором трипановымсиним. При окраске по Лейшману данные образования прокрашивались ярко,часто легко удалялись с пластика при промывке, что позволяет предположитьв данных центрах слабые межклеточные контакты.

Однако при витальноймикроскопии этот центр плохо захватывает 0,04%раствор трипанового синего,что выявляет повышенную жизнеспособность клеток в этой области.Учитывая, что окраска по Лейшману позволяет зафиксировать и окраситьмембраны клеток, а окраска раствором 0,04% трипанового синего оценить примикроскопии жизнеспособность клеток, различная чувствительность клеток ккрасителям свидетельствует в пользу того, что центр таких колоний являетсязоной активной пролиферации клеток.При инкубации ОК SW620 в присутствии Ах в конечной концентрации10-5М отмечали наибольшее количество плотных клеточных контактов,характер роста клеточного слоя отличался от контрольного, что видно изрисунка 11.75БАГВРисунок 11 Характер роста клеток SW620 под воздействием Ах, увеличениеХ40.