Диссертация (Патофизиологическое значение ацетилхолина в пролиферации опухолевых клеток толстой кишки in vitro и in vivo), страница 7

В норме эти рецепторыили совсем не представлены или очень малочисленны на нормальных клеткахэпителия кишки[61; 114; 130]. Таким образом, в настоящее время идет сборпервичной информации о биологии влияния Ах на клетки РТК.В 1992 группой Frucht et al. (1992), при изучении рецепторов для Ах,расположенных на опухолевых клетках, было показано, что для большинстваклеточных линий эпителиального происхождения характерна конститутивнаяэкспрессия м-рецепторов к Ах [85].

Данная система, представленная Gpбелками, оказалась важным звеном в процессе пролиферации in vitro. Приисследовании in vivo данные эффекты были менее заметны. Авторыуказывают, что несмотря на то, что первично Ах описан как нейромедиаторнервной системы, его способность регулировать разнообразные процессы,связанные с заживлением и иммунным ответом при опухолевом росте,должны привлечь внимание онкологов [80]. Другие авторы [82] указывают нато, что особенности формирования в эмбриональном периоде органовиммунной системы, ЖКТ и ЦНС заставляет рассмотреть эти системы нетолько как взаимосвязанные, но и взаимозависимые части общего механизма,регуляции которых до сих пор не вполне изучены.

Учитывая это мнение,обоснованным является клиническая значимость охранительного режима длябольных с хроническими воспалительными заболеваниями ЖКТ. На нашвзгляд значимым является обнаруженная тесная связь заболеваний ЖКТ сдеятельностью нервной и иммунной системы [31; 133].В процесс воспаления физиологически вовлечены более чем 50 видовбиологически активных веществ, наименее изученными из которых являютсянейромедиаторы. Среди них Ах стал рекордсменом по формированиюбиологических головоломок. Исследования последних 15 лет установили, чтоАх участвует в процессах дифференцировки нормальных и миграцииопухолевых клеток, организации их цитоскелета и межклеточных контактов,41обеспечивает многие функций иммунокомпетентных клеток.

Также былопоказано, что Ах может действовать как неспецифический ростовойстимулятор – описана активация пролиферации ОК через рецепторы кфакторам роста (например через систему фактора роста эндотелия сосудов(VEGF) и т.д.) [37; 66; 88]. In vitro были исследованы опухолевые клеточныелинии рака легких, молочной железы, некоторые линии аденокарциномтолстойкишки,предстательнойищитовиднойжелезы,яичников[49; 167; 168].К сожалению, современных отечественных данных о влиянии Ах наопухолевый рост нами не найдено, что ставит вопрос о необходимостиизучения данного вещества более подробно.42Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ2.1.Общий дизайн исследованияДля достижения поставленных целей был выбран подход сравнения иобобщения биологических эффектов от применения Ах в живых системах.Общая схема эксперимента представлена на рисунке 5.Рисунок 5 Общий дизайн исследованияТаким образом, мы достигали основной цели – получить две сравнимыебиологические системы, в которых отличался источник поступления Ах.2.2.Эксперименты in vitroДля определения влияния Ах in vivo в «закрытой» системе (опухолевыеклетки (ОК) линии SW620) был выбран дизайн исследования, представленныйна рисунке 6.43Рисунок 6 Дизайн исследования in vitroЦелью данного этапа было определение диапазона концентраций Ах,которые не будут обладать цитотоксическим действием на ОК, но смогутизменять их скорость роста.

Для этого из 5 вариантов ОК (HCT116, HT29,SW620, Caco2, HT29) клеток была выбрана линия SW620, которая обладаланеобходимыми техническими характеристиками: имела конститутивнуюсекрецию белка COX2, эпидермального фактора роста, мутацию apc;определенную скорость роста (близкую к скорости репарации тканейслизистой оболочки толстой кишки крыс), что в совокупности обеспечиваловысокую скорость наращивание клеток для дальнейшего депонирования ипозволяло соотнести результаты, полученные in vitro, и in vivo. Клеточнаялиния являлась монослойной, что осложняло работу на цитометре ввидувысокой агрегационной активности, однако из всех предложенных вариантов,именно эта линия показала наиболее воспроизводимые результаты при работе.442.2.1.Описание клеточной культуры SW620Опухолевая линия SW-620 (ATCC №CCL-227TM) рака толстой кишкичеловека, полученная из метастатического узла аденокарциномы толстойкишки 51-летнего белого мужчины в 1976 году [57] была предоставлена ФГБУ«РОНЦим.Н.Н.БлохинаРАМН»НИИЭДиТОлабораториейэкспериментальной диагностики и биотерапии опухолей в рамках договора.Культивирование ОК осуществляли согласно рекомендаций ATCC.

ДляподдержанияиспользоваликультуральнуюсредуRPMI1640,клеткисодержали в культуральных флаконах (КФ) различного объема (США Corning)в СО2-инкубаторе, при 370С, в атмосфере СО2 -5%, и влажности 95% смомента размораживания материала и до 12 пассажа. Для сохраненияасептических условий использовали одноразовый пластик и помещенияламинарного шкафа. Все дальнейшие исследования проводили в аналогичныхусловиях.2.2.2. Методы работы с культурой клетокПоддержание логарифмической фазы роста культуры осуществлялиметодом субкультивирования каждые 48 часов. Для приготовления основныхсред, красителей и буферов при рутинной работе с клетками использовалиследующие протоколы:1.

Питательная среда культивирования (ПСК) для роста клеточных линий наоснове RPMI-1640 (ПанЭко, РФ). Содержит 10% телячьей эмбриональнойсыворотки (ТЭС) (Perbio, HyClone, США), 2mM/мл глутамина (ПанЭко,РФ), 0,1мг/мл гентамицина (ПанЭко, РФ);2. Среда для замораживания клеточных линий. Для криоконсервацииклеточных культур готовили среду, содержащую 90% ТЭС и 10%криопротектора диметилсульфоксид (ДМСО) (ПанЭко, РФ).

Использовали900мкл для каждых двух миллионов клеток;3. Фосфатно-солевой буфер (ФСБ) содержал навески солей: NaCl 40 гр.,KCl 1гр., Na2HPO4x12H2O 9 гр., KH2PO4 1 гр. - для приготовления 0,545литра 10-кратного концентрата, соли растворяли в дистиллированной воде,pH полученного раствора 7,2-7,4. После приготовления раствора егохранили при +40С 30 дней, перед использованием разводили вдистиллированной воде.4. Приготовление раствора трипанового синего для витального окрашиванияклеток. Использовали жидкий краситель трипановый синий (Flow Lab,Великобритания).Дляопределенияжизнеспособностиклетокиспользовали 0,2% раствор красителя в ФСБ.

Перед использованиемраствор красителя фильтровали для удаления конгломератов.Для достижения поставленных целей, после получения отсева клеточнойпопуляции проводили их(1) масштабирование и (2) депонирование. На первомэтапепроводилимасштабированиеисубкультивированиеОК,навтором - обеспечивали сохранность образцов для дальнейшей работы.Масштабирование и субукультивирование опухолевых клеток включало в себя(1)размораживание,(2)оценкужизнеспособности,наращивание(3)популяции в культуральных флаконах (КФ). Размораживание клетокпроводили по мере необходимости. Криопробирки с клетками размораживалиѐмкостиводянойцентрифугированиебани+370С,3минутыпри5 минут,после1000 об/мин.чегоОсадокпроводилиотмывалиоткриопротектора дважды, затем разводили в 1 мл СК, оценивали количествожизнеспособных клеток по методу Гольдмана и производили высадку клеток вКФ 3*105 клеток/мл.

Определение количества живых клеток по Гольдманупроводили в камере Горяева. Для этого суспензию ОК смешивают с равнымколичеством раствора красителя 0,2% трипановый синий.Примасштабированииисубкультивированииклеточноймассыиспользовали методы рассева клеток эукариот. Для этого клетки удаляли сподложки стерильными растворами Версена (РФ, ПанЭко) и 0,25% трипсина(ПанЭко, РФ) по стандартной методике работы с клетками эукариотов, атакже учитывая особенности работы, описанные в руководстве ATCC. Вдальнейшем клетки осаждали при центрифугированием при 1500 об/мин465 минут, супернатант удаляли, клеточную суспензию и разводили доконцентрации 106 клеток/мл, затем рассевали в КФ.

Субкультивированиепроводили до 6-ого пассажа, после чего клетки депонировали.С целью проведения депонирования проводили замораживание клеток.Для этого их удаляли с подложки как описано выше, отмывали от остатковсреды центрифугированием при 1500 об/мин в течение 5 минут, супернатантудаляли, осадок ресуспендировали в остаточном объеме и подсчитывали пометоду Гольдмана. По результатам подсчета клетки разводили в смеси длязамораживания до концентрации 106 кл/мл. Суспензию клеток распределялипо криопробиркам объемом 1мл, которые заранее маркировали.

Пробиркихранили в морозильной камере при -80° С не более 2 месяцев.При необходимости проводили синхронизация клеточного цикла. Длястандартизации условий проведения экспериментов использовали клетки наодной и той же фазе клеточного цикла (митозе). Для синхронизацииклеточного цикла перед замораживанием клеточной культуры использовалиблокирование клеточного цикла в популяции путем удаления митотическиактивной популяции при встряхивании. Для этого производили наращиваниеклеток до стадии монослоя, затем КФ на 20 минут помещали на термо-качалку(+370С, 400 об/мин). Слущивающиеся клетки собирали и использовали длязамораживания. В экспериментах, связанных с колониеобразованием и/илитребующихустановлениякультивированияфазыпопуляцииклеточногоклеточныйциклациклпередначаломсинхронизировалитрипсинизацией в процессе ведения культуры.

Культуру клеток высевали наКФ в низкой плотности (10-5 кл/мл или 10-4 кл/см²); через 18 часов посленачала инкубации добавляли колмицид в конечной концентрации 0,06 мкг/мли инкубировали клетки еще 4 часа. Затем среду удаляли и монослойтрипсинизировали 0,1% раствором трипсина, после чего КФ встряхивали,постепенно отбирали открепившиеся клетки и центрифугировали 2 минутыпри 200 об/мин.

После удаления супернатанта к осадку добавляли 1 мл СК иподсчитывали количество живых клеток по Гольдману. Затем клетки высевали47по КФ по 4*105 клеток/мл. В остальных случаях клеточный цикл временноблокировали обработкой колмицидом после 2-ого культурального пассажа.Данный метод позволяет накопить максимальное количество клеток вметафазе (80-86%). Для этого монолслой 2-ого пассажа после размораживанияклеток обрабатывали колмицидом как описано выше, но без последующейтрипсинизации. После окончания инкубации с препаратом среду из КФудаляли, заменяли несколько раз на чистую СК, после чего добавляли полнуюСКиинкубироваливСО2-инкубаторе.Дляработыиспользовалисинхронизацию на 2 пассаже после размораживания ОК и время работы неболее чем 6 культуральных пассажей.Для определения эффектов, оказываемых Ах на клетки линии SW620использовали следующие протоколы:(1)определение популяционных эффектов после обработки клеток АХ,(2)определение жизнеспособности после обработки Ах и методы оценкискоростироста:МТТ-метод,тестымиграции,CVS-метод,колониеобразование, витальное окрашивание по Гольдману и световаямикроскопия.