Диссертация (Патофизиологическое значение ацетилхолина в пролиферации опухолевых клеток толстой кишки in vitro и in vivo), страница 10

Для животных крепкой конституции время составило 15±0,5минут, и для животных деликатной конституции 22,5±0,8 минуты.57На втором этапе подготовки исследования проводили анализ данныхлитературы о предпочтительных моделях химической индукции опухолевогороста, определяли количество и кратность введения канцерогена дляполучения медленного опухолевого роста. На этом этапе проводили оценкувозможных токсических эффектов от применения канцерогена, вносиликоррективы для дальнейшего отбора животных для работы. При анализерезультатов, полученных на этом этапе, разрабатывали способы профилактикипослеоперационныхосложнений,уточнялидальнейшийобъемморфологического и биохимического исследований.

После разработки моделииндуцированного опухолевого роста на фоне разрешившегося воспаления,приступали к непосредственному моделированию. Для этого на одинэксперимент выбирали животных, отвечавших требованиям, установленнымна предварительном этапе. Их разделяли на группы, проводили опыт, послечего подвергали эвтаназии и проводили отбор биологического материала. Вобразцахслизистойконцентрациюоболочкитолстойэпидермальногокишкифактораиростакровиисследовалииматриксныхметаллопротеиназ 3- и 9-ого типов. Параллельно проводили морфологическуюверификацию наличия опухолевого роста.2.3.1.

Экспериментальные моделиДляиндукцииязвытолстойкишкибылаиспользованамодифицированная модель индукции язвы желудка предложенная S. Okabe[132] Для моделирования опухолей толстой кишки использовали вариантмодели с использованием канцерогена 1,2-азоксиметана S. Reddy [148]. Длядальнейшей работы эти модели использовали совместно.2.3.1.1. Моделирование язвы толстой кишкиВ качестве общего анестетика использовали препарат Zoletil100. Общаяхирургическая предоперационная подготовка включала в себя сбриваниешерсти, обработку кожи брюшка антисептическим раствором, фиксациюживотного мягкими вязками на подставке и принудительное спускание мочи.58Оперативный доступ обеспечивали переднебрюшной лапотротомией,подлежащие ткани разделяли тупым методом. Петли толстого кишечникаизвлекали тупым стоматологическим стеком для смешивания пломбировочноймассы, затем находили слепую кишку, проводили ее мягкое извлечение изполости.

Для упрощения работы был разработан и изготовлен на 3D-принтереоригинальный полистироловый аппликатор (см. рисунок 8) с повышеннойгладкостью, который имел различные варианты просвета окон для внесенияуксусной кислоты: 2,5; 3 и 5 мм. Максимальный объем кислоты 0,5 мл.На расстоянии 2 см от выхода из слепой кишки на ободочную кишкунакладывали аппликатор с диаметром отверстия 3 мм (см рисунок 8), послечего на 15 секунд наносили 10 мкл концентрированной уксусной кислоты.Рисунок 8 Оригинальный полистироловый аппликатор для ограничения истандартизации воздействия. Общий вид. По часовой стрелке от пинцета:отверстие диаметром 3 мм, 5 мм и 2,5 мм.Остатки кислоты удаляли стерильной фильтровальной бумагой, полечего кишку погружали в брюшную полость и проводили послойное сшиваниебрюшины, подкожно-жировой клетчатки, и кожи.

Использовали шовныйматериал – поликон 8.0 для внутренних органов и кожных прерывистых швов.Послеоперационную рану обрабатывали раствором «Террамицина» каждые 72часа до отпадания струпа. После операции животное помещали виндивидуальную клетку с толстым слоем опилок, при выраженном цианозеушной раковины под дно клетки клали грелку с теплой водой. С 4-ого часа59животному обеспечивали свободный доступ к воде, через 15 часов послеокончанияоперации – кормлениесухимгранулированнымкормом.Проводили наблюдение за аппетитом, жаждой, дефекацией и выделениями,осмотр швов, общий ветеринарный осмотр проводили ежедневно срегистрацией погибших животных.С 1-ого по 20-ые послеоперационные сутки проводили исследованиеизменения концентрации Ах в образцах слизистой оболочки, полученной примоделировании язвенного дефекта толстой кишки.

В работе использовалихимический метод «Определение ацетилхолина и других производныхкарбоксиловой кислоты» Hestrin Sh., (1949) в модификации Трубицыной И.Е.(Трубицына, 2005). Данный метод основан на реакции Ах с гидроксиламиномв щелочной среде с образованием гидроксамовой кислоты, которая с солямитрехвалентного железа при рН=1,2±0,2 даѐт цветную реакцию.Ход определения был следующим: у животных проводили взятие 50мгслизистой оболочки, которую консервировали в 1 мл деионизированной видыс 10 мкл прозерина, после чего хранили при температуре -700С до 6 месяцев.Определение концентрации Ах.

Щелочной гидроксиламиновый реагентготовили непосредственно перед использованием. Оптическую плотностьполученных растворов измеряли при длине волны 480 нм.Кровь от животных для ИФА собирали в пробирки с ЭДТА,аутопсийный материал, получаемый от животных доживших до 70-ого днятакжеиспользовалидлябиохимическихисследованийИФА-методом.Параллельно, от этих же животных проводили отбор образцов длягистологического исследования.

Для параллельного исследования кишкуосвобождали от каловых масс, разделяли по анатомическому шву, и левуючасть использовали для ИФА, а правую для гистологического исследования.2.3.1.2. Моделирование опухоли толстой кишкиДля воспроизведения опухоли ТК использовали введение канцерогена1,2-азоксиметана (АОМ) (Sigma-Aldrich, США). Были отработаны две схемы60введения, которые отличались кратностью (1 и 2 раза с промежутком 14 дней)и разовой дозой вещества-индуктора (10 или 15 мг/кг). За основу дозированиявзяты исследований группы Bissahoyo [46].

Так как задачей было определитьбиологический эффект малых концентраций Ах первое введение АОМпроводили на 14-ые сутки после операции. Перед введением животное на4 часа лишали корма, мягко фиксировали, взвешивали и внутрибрюшинновводили необходимое количество канцерогена, затем выпускали в клетку.Доступ к воде обеспечивали сразу, через 4 часа – к пище. При повторномвведении препарата, проводившееся через 14 дней манипуляции повторяли.После второго введения животные жили до 56-ого дня, после чегопроводили убой и отбор материала для биохимических методов и длягистологического анализа.Материал для биохимических исследований брали от 5 животных, дляисследования усредняли от каждой группы, как описано выше.

Материал дляпроведения гистологического исследования брали параллельно.2.3.1.3. Моделирование язвы толстой кишки в сочетании с введениемканцерогенаДля проведения непосредственного эксперимента формировали группыживотных: 1 - интактные (контрольные), 2 - только с формированием язвы поописанной методике;3 - только с введение АОМ по описанному методу; 4 - ссочетанием язвы и АОМ. Последняя группа на 0-ой день эксперимента былаподготовлена к операции по описанной методике, затем Далее животныхсодержали до 70-ого экспериментального дня, после чего проводили убой иполучение биологического материала по описной методике.

Одновременно сотбором материала для биохимических исследований брали образцы длягистологического изучения.2.3.2.Биохимические методы и гистологическая техникаДля получения материала животных гуманно умертвляли. Эвтаназияпроисходила от передозировки эфирного наркоза с последующей дислокацией61и декапитацией. Затем проводили взвешивание, брали кровь, проводиливскрытие и взятие материала для гистологического исследования. Кровь дляопределения в сыворотке ММР и EGF брали у наркотизированных животных,из подмышечной вены путем венесекции с последующим сбором в пробиркидля сепарации сыворотки крови (BD, США). Форменные элементы кровиосаждалицентрифугированиемпри1500 об/мин10 мин.Сывороткураспределяли в пробирки, и хранили 6 месяцев при -20°С до использования.Материал слизистой оболочки брали одновременно с некропсией. Для этоготруп вскрывали, выделяли слепую и толстую кишку, которые разделяли на двечасти по продольному анатомическому шву. Правую часть использовали дляполученияслизистойоболочкидлядальнейшихИФА-исследованийколичества EGF и ММР 3 и 9 типов, а левую часть фиксировали врасправленном виде в 10% растворе формалина, с дальнейшей обработкой постандартной гистологической технике.

Батарея спиртов состояла из растворовэтанола с содержанием спирта 70%, 80%, 96%, и 100%. Образцыобезвоживали по 24 часа. После 100% этанола образцы выдерживали в смесиэтанол-ксилоливчистомксилоле.Заливкапроводиласьсогласнообщепринятой методике, для чего образцы помещали в смесь ксилол-парафини, затем, в жидкий парафин на 1-2 ч при 52-56оС. После заливки в парафинматериал остужали 24 ч, после чего вырезали блок с заключѐнным образцомдля нарезки серии лент по 4-5 срезов.

Для окраски ленту помещали наподготовленные стекла для гистологических исследований Menzel-Glaser(Thermo Scientific). Перед окрашиванием их освобождали от парафина, врастворителях по 2-5 мин: ксилол, спирт 100 %, 96 %, 80 %, 70 %, 60 %, вода.Для окрашивания стѐкла со срезами попеременно помещали в растворкрасителей, промывая водой, с последующим просветлением в карбол-ксилолеи ксилоле. Далее на препарат наносили каплю канадского бальзама кедровогомасла и накрывали покровным стеклом.

Микроскопия проводилась сиспользованием микроскопа Leica и фотоустановки, прилагающейся кприбору.622.4. Статистическая обработка результатовСтатистическуюпрограммыStatisticaобработку6.0.результатовДостоверностьпроводилиразличийприпомощиоцениваликакстатистически значимую при р<0,05. С целью выявления характерараспределения проводили предварительную статистическую обработку. Таккак анализ данных показал, что распределение носило не нормальныйхарактер, это предполагало использование непараметрического критерияМанна-Уитни для парных зависимых сравнений, Уилкоксона для парныхнезависимых выборок и ANOVA-теста для многопараметрического сравнения.Для уточнения различий между группами независимых выборок такжеиспользовали методы регрессионного анализа в варианте ANOVA.63Глава 3.