Диссертация (Патофизиологическое значение ацетилхолина в пролиферации опухолевых клеток толстой кишки in vitro и in vivo), страница 18

Частота этих изменений варьировала, а сами нарушения структурыоргана могли сочетаться между собой.Как и в группе с язвой, со стороны органов дыхания наблюдали такиеизменения как: снижение плавучести, мелкоточечные и крупноочаговыекровоизлияния, участки спадания ткани. В сравнении с группой с введениемАОМ могли выявляться более выраженные изменения тканей печени.В совокупности, данные признаки указывали на то, что воспалениеявлялось фоном для развития снижения иммунной реактивности организма, авведение АОМ (ввиду его гепатотоксичности) усугубляло эти проявления.117Интереснымфактомоказалосьто,чтооднимизпроявленийспецифичности сочетанного действия АОМ и язвы явилось изменениеуглеводного обмена, выражавшееся увеличением количества висцеральногожира в ущерб подкожному.

Этот факт требует отдельного исследования, таккак роль жировой ткани как источника стимуляторов опухолевого ростатолстой кишки хорошо освещена в литературе [55; 184]. Типичная картинатрупа представлена на рисунке 24.Рисунок 24 Типичная макроскопия трупа крыс из 4-ой группы (язва+АОМ).А – общий вид трупа, 1 - зона сформированной язвы с местами увеличениялимфоидных участков; Б – общий вид селезенки: бугристость структурыоргана, притупление краѐв, увеличение объема органаНекропсия с целью проведения морфологической оценки состояниятканей кишки показала, что наиболее выражено изменялась картина СО ТК:наряду с полиполипозом были выявлены зоны роста аденокарцином.Количество полипов на гистологическом срезе варьировало и на образцах118длинной 2,5 см толстой кишки их насчитывали до 8 штук; при этом степеньдисплазии определялась как выраженная.

Типичная морфологическая картинапредставлена на рисунке 25.АВБГРисунок 25 Микрофотографии слизистой оболочки толстой кишки в 1 см отиндуцированной язвы. А и Б - окраска по Массону. А – группа контроля Б –Группа с индуцированной язвой. В и Г - окраска гемотоксилин-эозин.В - общий вид слизистой оболочки в группе с АОМ Х100; Г - общий видслизистой оболочки в группе с сочетанием АОМ и язвы, увеличение Х100; 1 –полип, 2 – зона десквамации слизистой оболочки, 3 – белковые отложенияС целью сравнения выявления действия АОМ в сочетании с язвой былапроведена сравнительная морфометрическая оценка высоты полипов и ихплощади в двух группах: АОМ и АОМ+язва. Установлено, что в группе ссочетанием АОМ и язвы существовало статистически значимое различиевысоты и площади полипов в группах в сравнении с группой только синдуцированным ростом опухолей (группа АОМ). В группе АОМ среднее119количествополиповсоставило – 2-3полипасреднейплощади352279±71370,4 мм² и средней высоты 933,0±233,3 мм, с умеренной степеньюдисплазии.

Для группы «язва+АОМ» эти показатели были иными – среднееколичествополиповсоставило1-3,0;ихсредняяплощадьбыла188393,0±72808,7 мм², а средняя высота 437,0±125,6 мм. При этом степеньизменениятканейустановлено,чтооцениваласьсуществоваликаквысокая.статистическиТакимобразом,значимыебылоразличияигиперпластические изменения слизистой оболочки в группе с сочетаннымдействием АОМ+язва, которые имели тенденцию к более выраженному игрубому проявлению. Также была проведена оценка общего состоянияслизистой оболочки.

Данные анализа представлены в таблице 21.Таблица 21Морфометрические показатели слизистой оболочки толстой кишки у крысгрупп 2 и 4Измеряемые параметры, мкмВысота каѐмчатых энтероцитов поверхностислизистой оболочкиВысота бокаловидных энтероцитов криптТолщина слизистой оболочкиТолщина подслизистой оболочкиТолщина кишечной стенкиГруппыАОМАОМ + язва21,3±2,422,5±7,624,0±4,131,5±8,6414,4±73,4546,6±185,824,0±3,666,4±32,4551,5±60,0723,0±231,8Показано, что в группе АОМ+язва существуют гетерогенные изменениятолщины подслизистой оболочки и самой кишечной стенки в сторону ихувеличения, однако данное исследование необходимо провести на большемколичестве животных, так как существует проблема широких диапазоновколебаний показателей из-за индивидуальных особенностей.

Для остальныхорганов были показаны уже выявленные изменения: гемосидероз в тканиселезенки, выраженный стеатогепатит, изменения со стороны органовдыхания.120Обобщая полученные данные о состоянии СО ТК можно констатироватьналичие активного роста полипов и тубуллярно-ворсинчатых аденом в группес сочетанием воспаления и АОМ. Важным изменением слизистой оболочкиможно считать сочетание гиперпластических полипов и тех, что явно былииндуцированы АОМ и имели высокую степень дисплазии.Учитывая опубликованные [15] и полученные нами о данные[27; 31],было доказано, что Ах оказывает влияние на скорость регенерации СОорганов ЖКТ. Нами установлено, что уровень Ах в зоне воспалениянегармонично зависим от интенсивности воспаления.

Таким образом,биологическое действие Ах можно рассматривать как пропролиферативноедлятехклеток,которыебылиподвергнутытрансформации.Нашиисследования показали необходимость уточнения механизмов данногоявления. В частности, необходимо понять роль оксида азота и продуктовпротеолиза клеточной стенки на начальном этапе формирования полипа, атакже на первых этапах роста опухоли толстой кишки на фоне воспаления.Кроме того, желательно разработать не хирургическую модель воспалительнохимической инициации опухолевого роста для того, чтобы свести кминимальному действие белков острой фазы, действие которых может влиятьна результативность работы.3.2.4.СравнительнаяоценкаконцентрацийEGFиматриксныхметаллопротеиназ 3 и 9 типов в крови и образцах тканей вэкспериментальных моделяхУчитывая результаты исследования in vitro и морфологическогоисследования СО ТК в группах с введением АОМ, мы предположили наличиесвязи между влиянием Ах в тканях около сформированной язвы, и тем, какреагирует микроокружение.

Для этого провели количественное определениеконцентрации матриксных металлопротеиназ (3 и 9 типов) и главногоэпидермального фактора роста (EGF) в образцах крови, слизистой оболочкислепой и ободочной кишки. Полученные данные представлены в таблице 22.123Таблица 22Концентрация ММР 3 ММР-9 и EGF в различных биологических образцахСреднее определяемое количество вещества, в образцах (пг/мг веса ткани)МестополучениММР-3ММР-9EGFя образцаМе(25;75)%Ме(25;75)%Ме(25;75)%Сл.4,03,6;5,54,1;12,70,130,1;0,24,3*кишкаКонтроль (n=25)Т.

кишка3,33,3;3,73,22,5;6,40,40,3;0,4Кровь0,080,07;0,090,10,06;0,1Не детектируетсяСл.4,03,6;5,54,1;12,70,130,10;0,184,3*кишкаАОМ (n=25)Т. кишка3,23,3;3,73,152,5;6,40,35;0,40,37##Кровь0,07;0,090,0950,06;0,1Не детектируется0,08 #Сл.4,463,45;4,643,52,8;3,80,10,1;0,3кишкаЯзва (n=35)Т. кишка3,83,5;4,25,03,2;6,10,170,08;0,30Кровь0,090,08;0,10,0750,06;0,7Не детектируетсяСл.2,5;3,73,02,48;4,730,070,06;0,183,0 (##)кишкаЯзва+АОМ (n=15)Т. кишка4,073,0;5,35,43,1;12,90,12**(*) 0,08;0,18Кровь0,09;0,10,080,07;0,13Не детектируется0,09(#)*статистически значимые различия между группой контроля и группой с язвой р=0,03** статистически значимые различия между группой контроля и группой с язвой+АОМ р=0,05(*)статистически значимые различия между группой контроля и группой с язвой р=0,01# статистически значимые различия между группой контроля и группой АОМ р=0,0079## статистически значимые различия между группой АОМ и группой язва+АОМ р=0,03(#) статистически значимые различия средних в группах АОМ и язва+АОМ р1=0,035, р2=0,07(##) статистически значимые различия в группах язва и язва+АОМ р=0,017Группа и количествообразцов121122Для уточнения нашей гипотезы о влиянии Ах как активатора системыEGF и матрик-моделирующих белков, было проведено сравнение группыконтроля со всеми экспериментальными группами.

Сравнение проводилоськак совокупно (статистическая значимость различий не выявлена), так ииндивидуально.Из таблицы 22 видно, что для каждого биологического маркерасуществуют свои достоверные различия, и они зависят как от типа тканей, таки от локализации мета взятия образцов. Для ММР-9 статистически значимыеразличия были выявлены между группой контроля и группой с язвой (р = 0,03)в случае слепой кишки. Значимые различия определяли между группойконтроля и группой с язвой+АОМ (р = 0,05) и, между группой контроля и сязвой р = 0,01для тканей толстой кишки (ободочная).

Для крови показанастатистически значимое изменение при сравнении контроля и группой АОМ(р = 0,0079).Далее было проведено парное сравнение между группами концентрацийММР-3 ММР-9 и EGF в образах материала, полученного от разных группживотных. При парном сравнении групп определено наличие статистическизначимых различий в между группой АОМ и группой язва+АОМ (р = 0,03) втканях слепой кишки, и толстой кишки. Для крови такие изменения былихарактерны для ММР-3 группы АОМ и АОМ+язва.Таким образом, показано, что маркером изменения структурнойорганизации слизистой оболочки может являться ММР-3 тканей кишки, иММР-9 для слепой кишки, в то время как показатели крови указывают наналичие изменений в более тяжелых случаях, когда процесс опухолевогороста набрал максимальную силу [28].Значимость определения EGF в сыворотке крови ввиду его низкихконцентраций крыс мы не считаем перспективным, однако данный вопростребует уточнения.

Мы считаем, что дальнейшие работы по изучениюэффектов, оказываемых данным веществом in vivo следует проводить123учитывая этот факт и выбирая более чувствительные методы детекции нежелиИФА.Обобщая данные полученные на этом этапе исследования, обнаруженонесколько лимитирующих работу факторов. Во-первых, наличие выраженнойгепатотоксичности АОМ, что является предсказуемым, но индивидуальноплохо прогнозируемым явлением. При проведении данного типа исследованияименно возраст животного и его физическая кондиция могут быть марекерамидля отбора экспериментальной группы.Во-вторых установлено, что Ах вовлечен в процесс заживления раны,имеет определенную динамику нарастания и снижения концентрации,максимально определяется между 3 и 6 денем после индукции язвы кишки.В-третьих, вероятнее всего, действие Ах может выходить за рамкиодного органа в силу его высокой биологической доступности для другихорганов, и, в частности органов дыхания.В-четвертых, несмотря на минимизированное действие Ах на сампроцессинициаторногоканцерогенеза,еговкладвнеполноценноеформирование межклеточных контактов достаточно очевиден, учитываяданные проведенных in vitro исследований.