Диссертация (Физиолого-биохимические особенности АТФазной активности крови и молока у продуктивных животных с различными типами обмена веществ в постнатальном онтогенезе), страница 9

Однако утверждать, что она транспортирует анионычерез мембрану, пока нет оснований, так как показано, что анионы неактивируют, а неспецифически ингибируют фермент, связываясь с анионнымучастком. Стехиометрическое отношение анионов к АТФ не установлено, инельзя исключить загрязнений митохондриями фракций плазматическихмембран (Утеулин К.Р., Иващенко А.Т., 1982).Исследования Кометиани З.П., Векуа М.Г. (1988) аниончувствительнойАТФазной активности в тенях эритроцитов, где исключено загрязнениемитохондриями,показало,чтоэтаактивностьсильноотличаетсяотмитохондриальной, не ингибируется тиоцианатом и почти нечувствительна колигомицину. Однако оказалось также, что SITS-чувствительный переносанионов, обнаруженный впервые в эритроцитах, а затем и в других объектах, несвязан с АТФазной активностью и, по-видимому, является процессом вторичноактивного транспорта, движимого градиентом Na+.

Предполагают, что вплазматической мембране чувствительность к анионам проявляет Са-АТФаза(Кометиани З.П., Векуа М.Г., 1988).В микросомальных препаратах слизистой желудка животных обнаруженфермент — К, Н-АТФаза, гидролизующий АТФ с высокой скоростью, причемэтотпроцессстимулируетсяионамиК+,ускоряющимираспадфосфорилированного интермедиата реакции. К, Н-АТФаза нечувствительна коуабаину, ионам Na+ или бикарбонату и ингибируется сульфгидрильнымиреагентами.

Предполагают, что фермент служит созданию высокой кислотностижелудочного сока, транспортируя Н+ и К+ со стехиометрией 3,5К+:4Н+: 1 АТФ.Вочищенныхпрепаратахферментаобнаруженыдваполипептидасмолекулярной массой 100 000 и 84 000. Для осуществления транспортной47функции необходимо наличие, по крайней мере, их димера с молекулярноймассой ~ 200 000. Как и для других транспортных АТФаз, для К, Н-АТФазыбольшое значение имеет липидное окружение и физико-химическое состояниебислоя (Скворцевич Е.Г. 2000).В результате длительных и упорных усилий Опритова В.А.

(2000)обратимыеН+-АТФазывыделенынавсехмембран,осуществляющихокислительное (бактерии и митохондрии эукариотов) или фотосинтетическое(фотосинтезирующие бактерии и хлоропласты эукариотов) фосфорилирование.Продемонстрировано сходство их состава и свойств, что предполагаетуниверсальность механизма их функционирования в системе мембранногофосфорилирования. Проведена реконструкция выделенных АТФаз в природныеи искусственные мембраны. Результатами исследований автора установлено, чтофункциональный комплекс обратимой Н+-АТФазы хлоропластов, подобноАТФазам других источников, представляет собой систему из двух элементов.Центральным элементом комплекса является высокомолекулярный белок,обладающий АТФ-синтетазной и АТФ-гидролазной активностью (Опритов В.А.,2000).Более подробный анализ структуры и функций составных элементов Н+АТФазы можно найти в обзоре Кагавы и др.

( Kagawa et ai., 1979). Несмотря настользначительныедостижениявисследованииН+-АТФазостаетсянеизвестным механизм трансформации энергии градиента электрохимическогопотенциала ионов Н+ в энергию макроэргических связей молекулы АТФ.АниончувствительнаяАТФазаширокораспространенавживыхорганизмах. Она обнаружена в бактериях (Marunouchi T. еt al., 1967), врастительных (Nelson N. еt al., 1962) и животных клетках (Racker E. 1962).В бактериальных клетках анионная АТФаза связана с мембраннымиструктурами и практически отсутствует в растворимой части гомогенатов. Так,после разрушения ультразвуком грамотрицательных бактерий Thiobacillusthiooxidans наибольшая активность SO-3 - стимулируемой АТФазы наблюдаласьв осадочной фракции, содержащей мембраны (Marunouchi T.

еt al., 1967; 1969).48В фотосинтезирующих бактериях Rhdospirillum rubrum АТФаза, стимулируемаясульфатом, локализована в мембранах хроматофоров (Webster G.D. et al., 1977;1978).АТФаза, активируемая бикарбонатом и ингибируемая тиоционатом,обнаружена в плазматической мембране Esherichia coli (Gunther T. еt al., 1974) иклеточной мембране Paracocus dinitrificans (Fergusson S.J.

et al., 1977). Наличиеаниончувствительной АТФазы установлено в мембране грамположительных идругих бактерий (Ishida M. еt al. 1969), существенно отличающихся по обменувеществ и по способу энергообеспечения. Имеются сведения о наличии НСО3АТФазы в плазматических мембранах растительных клеток (Nelson N.

еt al.,1972; Rungie J.M. et al., 1973; Sullivan C.W. et al., 1975).АТФаза, осуществляющая транспорт ионов Cl- в нейрон противэлектрохимического градиента и активируемая ионами Cl- и/или HCO3-,подробно изучена в работе Мензикова С.А. (2007). Автор отмечает, что Cl,HCO3--АТФаза из мозга животных имеет молекулярную массу 360 кДа исостоит у рыб из одной субъединицы (56 кДа), а у крыс из трех субъединиц (57,53 и 48 кДа).

Изученная АТФаза значительно отличалась по молекулярнымсвойствам от Na/K-АТФазы, но по субстратным свойствам сходна с ней. Данныйфермент активируется анионами HCO3-, SO42-, SO32-, а анионы SCN- и NO3ингибируют его. Ионы Cl- активировали АТФазу начиная с концентрации 0,7мМ(Мензикова С.А., 2007)Утеулин К.Р. и Иващенко А.Т. (1978, 1982) по степени влияния наАТФазнуюактивностьанионовделятихнатрибольшиегруппы:ингибирующие, стимулирующие и малоэффективные.

Учеными установлено,что к ингибирующим анионам относятся NO2-, ClO4-, F-, SCN-, стимулирующиманионы HCO3-, CO32-, SO42- , малоэффективным- анионы HSO4-. В связи с тем,что вышеназванные анионы таким же образом влияли и на растворимуюмитохондриальную АТФазу F1, авторы выдвинули предположение о сходствеHCO3- - АТФазы эритроцитов с F1-АТФазой митохондрий.Исследования Каландаришвили Ф.А. и др. (1977) на основании данных о49том, что ядерная АТФаза подавляется олигомицином и грамицидином С иактивируется динитрофеноломтакже предположение о способности ядер кокислительному фосфорилированию. Авторы считают,что в ядерныхоболочках содержится АТФаза типа сопрягающего фактора Рэкера F1, при этомданная АТФаза не активируется натрием и не подавляется оуабаином.Однако, ядерная АТФаза имеет и свои особенности, отличающие ее отмитохондриальной; в частности, по данным Збарского И.Б.

(1973) имеетсясущественнаяразницаобеспечивающихвконцентрацияхсульфитаибикарбоната,полумаксимальную скорость АТФазной реакции длямитохондриальной и ядерной АТФаз.Кроме того, существенное отличие АТФазы ядер от АТФазы митохондрийбыло установлено Иващенко А.Т. (1981) при исследовании способностидвухвалентных катионов стимулировать действие бикарбоната на гидролизАТФ. Так, например, катионы Mg2+ наиболее сильно стимулировали АТФазнуюактивность, а катионы цинка, бария и никеля ее ингибировали. Ионы Mn2+ и Co2+незначительно активировали АТФазу.

С влиянием Ca2+ связано повышениеисходной активности АТФазы ядер, однако бикарбонат не стимулировалгидролиза АТФ в присутствии кальция. В отличие от ядерной АТФазы, катионыCo2+ и Mn2+ существенно стимулировали АТФазную активность митохондрий.Кроме того, установлено, что ядерная и митохондриальнаяфункционируютвразныхдиапазонахpH.Так,максимумАТФазыактивностимитохондриальной АТФазы наблюдался при pH 8,5 - 9,0, в то время как Mg2+ АТФаза ядер практически не зависела от pH, а активность HCO3- стимулируемой АТФазы в щелочной среде уменьшалась. Исходя из этих данныхИващенко А.Т. (1978) сделан вывод, что в ядрах имеется своя H+ - АТФаза,отличная от митохондриальной сопрягающей системы.Наиболее полно исследованы НСО3- -АТФазы, обнаруженные в разныхорганах и тканях животных: в слизистой оболочке желудка лягушки(Берсимбаев Р.И., Шайхин С.М., 1979; Kasbekar D.K. et al., 1965; Koenig C.

еt al.,1970; Limlomwongse L. et al., 1970; Blum A.L. et al., 1971; Forte J.G. et al.,1973),50крысы (Иващенко А.Т. и др., 1975, 1981; Narumi S. еt al., 1973; Soumarmon A. еtal., 1974), кролика (Amelsvoort J.M. et al., 1977), свиньи (Schreijen J.J. et al., 1980),цыплят-бройлеров (Рыжкова Г.Ф., 2005; Мосягин В.В. 2011), собаки (Spenny J.G.et al., 1973; Tague L.L. et al., 1977), ящерицы (Pont J.J.

et al., 1972) и угря(Morisawa М. еt al., 1976).Применение в рационах цыплят-бройлеров биостимуляторов на основеянтарной кислоты, по данным Александровой Е.В. (2012) повышает активностьHCO3--АТФазы мембран эритроцитов на 13,0 -27,5 %, ядерных мембран -на 22,428,3% по сравнению с контролем.Таким образом, в настоящее время в литературе представлено большоеколичество сведений по изучению транспорта ионов и функционированию Mg2+, Ca2+-, Na+,K+-, H+-АТФаз различных органов и тканей животных в зависимостиот ряда факторов (Кагава Я., 1985; Болдырев А.А.

и др., 1985, 1998; ВишняковС.И.,1988; Фурман Ю.В., 1991; Рыжкова Г.Ф.,2005; Мосягин В.В.,2011). Вместес тем, практически отсутствует информация о видовых особенностях влияниявозраста и физиологического состояния на активность АТФаз продукциисельскохозяйственных животных - молока коров и свиней, мышечной тканицыплят-бройлеров.С учетом вышеизложенного целью работы явилось изучение взаимосвязиактивностиАТФазфизиологическимиклетокикрови,молокабиохимическимиипроцессамимышечнойвэтихтканиссистемахвпостнатальном онтогенезе у продуктивных животных с различными типамиобмена веществ (крупного рогатого скота, свиней и цыплят-бройлеров) взависимости от физиологического состояния, обусловленного генетическимпотенциалом (породой, кроссом) и возрастом животных.Это определило общую направленность работы, выбор методическихподходов и экспериментальных моделей.2.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙИсследования проведены в 2009…2013 г.г. на базе кафедры физиологииживотных имени А.Н. Голикова ФГБОУ ВПО «Московская государственнаяакадемия ветеринарной медицины и биотехнологии имени К.И. Скрябина» нафизиологическиздоровыхагропромышленногоживотных,производствапринадлежащихКурскомуРоссельхозакадемии,НИИ«Троицкомусвинокомплексу», племенному заводу ЗАО «НУКЛЕУС» «ГК Агро-Белогорье»,птицефабрикам «Курская», «Красная поляна», «Юбилейная».Общаясхемаисследованийпредставленанарисунке1,объемисследований представлен в таблице 1.Длярешенияпоставленныхзадачработусэкспериментальнымиживотными выполняли в соответствии с «Правилами проведения работ сиспользованиемэкспериментальныхживотных»(приложениекприказуминистерства здравоохранения СССР от 12.08.1977 г.