Диссертация (Физиолого-биохимические особенности АТФазной активности крови и молока у продуктивных животных с различными типами обмена веществ в постнатальном онтогенезе), страница 10

№ 7550) и ХельсинскойДекларацией 2000 г.Алгоритм выполнения исследований был следующий:1.Крупныйрогатыйскот,свиньиицыплята-бройлерыбылираспределены в группы по принципу аналогов (по возрасту, массе тела,происхождениюиразвитию).Рационыопытныхживотныхбылисбалансированы по питательным, минеральным и витаминным компонентам(Калашников А.П. и др.,2003) (приложения 1,2,3).2.Определяли основные физиологические показатели, живую массуживотных (И.П.

Кондрахин и др., 1985).52Физиолого-биохимические особенности АТФазнойактивности крови, молока, мышечной ткани упродуктивных животных с различными типами обменавеществ в постнатальном онтогенезеУ крупного рогатого скотав эритроцитах и молокев зависимости от:возрастаУ свинейв эритроцитах и молокев зависимости от:возрастастадиилактацииколичества иразмера жировыхшариковколичества иразмераэритроцитовколичества иразмеражировыхшариковпородыконцентрациистрофантина-G,ионов Na+ и K+концентрациистрофантина-G,ионов Na+ и K+возрастастадиилактациисезонагодаУ птицв эритроцитах имышечной тканив зависимости от:кроссаконцентрацииионов Na+ и K+количества и размераэритроцитовМетоды исследованийФизиологическиеБиохимическиеСтатистическиеВнедрение результатов научных исследованийУчебный процесс:Московская государственная академияветеринарной медицины и биотехнологииим.

К.И. СкрябинаСельскохозяйственные предприятия разныхформ собственности Курской и Белгородскойобласти,Всероссийскийнаучноисследовательскийитехнологическийинститут птицеводства РАСХН, Курскийнаучно-исследовательскийинститутагропромышленного производства РАСХНРисунок 1. Общая схема исследований53Таблица 1. Количество и возрастные группы исследованных животныхВозрастКоличество, головЖивая массаКрупный рогатый скот черно-пестрой породы6 мес.10146-189 кг12 мес.10221-253 кг24 мес.10385-439 кг27 мес.10410-485 кг3 года10504-536 кг4 года10552-606 кгКрупный рогатый скот симментальской породы6 мес.10149-186 кг12 мес.10226-259 кг24 мес.10410-468 кг27 мес.10421-497 кг3 года10519-552 кг4 года10566-612 кгСвиньи крупной белой породы2 мес.1018-21 кг6 мес.1075-85 кг12 мес.10112-128 кг2 года10173-188 кг3 года10226-253 кгЦыплята-бройлеры кросса «Бройлер-6»15 сут40175-234 г60 сут401530-1875 гЦыплята-бройлеры кросса «ISA»10 сут40264-298 г20 сут40723-859 г30 сут401035-1260 г40 сут402063-2308 г3.Кровь для исследований отбирали у крупного рогатого скота – изяремной вены, у свиней - из вены хвоста путем надрезания его вентральнойчасти.

Кровь стабилизировали гепарином из расчета 4-6 единиц на 1мл крови.У цыплят-бройлеров кровь отбирали из вен шеи и из подкрыльцовой вены.Кровь стабилизировали средой Алсвера.Стабилизированную кровь в термосе со льдом (+40С) доставляли через 2030 мин в лабораторию, для последующего анализа.54Отделение эритроцитов от плазмы проводили путем центрифугирования врефрижераторной центрифуге (+4…100C) в течение 30 мин при 3000 оборотах.Эритроциты после отделения от плазмы двукратно отмывали физиологическимраствором.4.

Пробы молока у крупного рогатого скота отбирали пропорциональносуточному удою, у свиней - после внутривенного введения 10…12 ЕДокситоцина из каждой функционирующей доли молочной железы.5. Мышечную ткань брали у цыплят в количестве 2-5 г и сразу жепомещали в термос со льдом для транспортировки в лабораторию.6. Количество и размер эритроцитов в крови крупного рогатого скота исвинейопределяливэлектронномсчетномаппарате«Целлоскоп»исканирующем проточном цитометре (СПЦ).7.

Количество и размер жировых шариков в молоке крупного рогатогоскота и свиней определяли по методике Н. Н. Липатова. Из молока отбиралисредние пробы, разбавляли дистиллированной водой в соотношении 1:100 имикроскопировали при увеличении в 1000 раз с иммерсией. Использовалсямикроскоп со встроенной видеокамерой Motic Images 2000 1.3, позволяющийсразу же получить цифровое изображение препарата. Вычисляли среднийдиаметр жировых шариков для каждой пробы по формуле:Д = Д1С1+Д2С2+ ... +ДnCn/ А(1)где Д- средний диаметр жировых шариков, мкм;Д1, Д2 ... Дn – фактический диаметра жировых шариков, мкм;С1, С2 ... Сn – число жировых шариков с одинаковым диаметром;А - общая сумма измеренных жировых шариков.8. Выделение мембран эритроцитов крупного рогатого скота и свинейпроводили гемолизом эритроцитарной массы в 0,4 М трис НСl с осаждениеммембран центрифугированием при 15 000 об/мин (Dodge J.T., Mitchell C.,Hanahan.

D.J., 1963). Выделение мембран эритроцитов цыплят-бройлеровпроводилиметодомзамораживания-оттаиванияврастворесахарозы,55содержащем 50 ммольл-1 трис-H2S04 буфер (pH 7,4) с последующимцентрифугированием 30 мин при 1000 об/мин (Мосягин В.В.,2011).9. Выделение мембран жировых шариков из молока, предназначенногодля определения АТФазной активности, проводили по методике, описанной вработе В.Н.Кириленко (1989).

Отобранное молоко центрифугировали при 3 000об/мин в течение 30 мин при температуре 30 оС. Полученные сливки подвергаличетырехкратной отмывке в 0,05 М трис - HCl буфере, содержащем 0,15 М NaCl и0,25 М сахарозы (буфер А). Отмытые сливки нормализовали до содержанияжира 35 % и вручную сбивали в масло. Полученную при этом пахту, подвергаличетырехкратной отмывке в 0,05 М трис – HCl буфере (pH 7,5), содержащем 0,09М KCl (буфер Б).

Отмытую пахту центрифугировали при 105 000 об/мин втечение 60 мин при температуре 5 оС. Отмытые мембраны жировых шариковресуспендировали в буфере Б до содержания 50 мг сухой массы мембран в 1 млсуспензии и использовали для определения АТФазной активности.10. АТФазную активность определяли двумя методами:а) первый -по Keeton, K.S., 1972, при этом активность общей АТФазыопределяли в среде, содержащей 150 мМ NaCl; 5,0 мМ KCl; 25 мМ трис-HCl (рН8,0), 3 мМ Na2АТФ, 3 мМ MgCl2, пробы инкубировали в течение 45 мин притемпературе 370С.

Реакцию прекращали путем добавления 1,8 мл 6%-ногораствора трихлоруксусной кислоты. Пробы центрифугировали при 0 0С и внадосадочной жидкости определяли содержание неорганического фосфора. ПриопределенииMg2+-АТФазы,т.е.оуабаиннечувствительнойАТФазывсубстратную среду вводили 10-4 М оуабаина (строфантина G), который подавлялактивность Na+, K+-АТФазы.б) второй –по Иващенко А.Т. и др.,1981. при этом активность АТФазоценивали по приросту неорганического фосфата после инкубации при 37 0С ивыражали в наномолях неорганического фосфата (Фн) отщепленного 1 мг белкав 1 мин.

При этом активность Mg2+ - АТФазы определяли в 50 мМ трис-H2S04буфере (pH 7,4) содержащем 60 мМ NaCl, 2 мМ АТФ и 2 мМ MgCl 2. АктивностьNa+, K+ - АТФазы измеряли в той же среде, заменяя 15 мМ NaCl на 15 мМ KCl.56Ca2+-АТФазную активность определяли, внося в среду 510-4 M CaCl2. УровеньHCO3--АТФазной активности оценивали по приросту неорганического фосфатапри замене 30 мМ NaCl на 30 мМ NaHCO3.11.Неорганическийфосфатопределялиспектрофотометрическимметодом (Кондрашова М.Н.

и др., 1965) при длине волны 390нм. Данный методоснован на изменении поглощения молибдата в не восстановленном комплексефосфорномолибденовойкислоты.Онпозволяетсбольшойточностьюопределять неорганический фосфор в присутствии легкогидролизируемыхфосфорных эфиров, а также по методу Чена (1957) в модификации КазенноваА.М. и соавт. (1984).12. Концентрацию мембранного белка определяли методом Lowry et al(1951), а также методом Варбурга и Кристиана (Досон Р., 1991), экстинкциюизмеряли при длине волны 260 и 280 нм в кювете с длиной оптического пути 1см.

Для вычисления концентрации белка использовали формулу:C (белка) = 1,55А2800,76А260 (мг/мл)13. Для разделения молочного белка на фракции применяли метод ионнообменной хроматографии. На разработанную для этих целей лабораторнуюустановку нами получен патент на полезную модель №131570 «Устройство дляионообменного разделения белковых фракций молока и их количественногоопределения»Образецпредварительнообезжиренногомолокананосилинарегенерированный, переведенный в активную форму анионит АВ – 17,заполняющий колонку с размерами 1,6 х 15 см, при помощи шприца. Затемчерез колонку пропускали буферный раствор – линейный градиент NaCl (0 – 0,5М) в 0,05 М трис - HCl, pH 8,6.

Линейный градиент ионной силы былсформирован при помощи градиентного смесителя, имеющего объем 250 мл;объем резервуара – 250 мл. Скорость подачи элюента 38 мл/ч. Фракциисобирали коллектором фракций 301-В, работающим совместно со счетчикомкапель и времени US-2. Объем фракции составил 5 мл. Элюированиепроисходило поэтапно, по мере нарастания ионной силы фракции. Первыми57былисобраныфракции,имеющиенизкуюмолекулярнуюмассуи,соответственно, ионную силу, последними - наиболее тяжелые фракции.Определение оптической плотности полученных фракций проводили наспектрофотометре СФ-26, в кюветах l = 1,0 см, при λ = 280 мм. Сбор фракцийпрекращали, когда оптическая плотность снижалась до 0,05.