Диссертация (Физиолого-биохимические особенности АТФазной активности крови и молока у продуктивных животных с различными типами обмена веществ в постнатальном онтогенезе), страница 5

В голове фосфолипидной молекулы лецитин имеются двезаряженные группы, расположенные на некотором расстоянии друг от друга.Два разноименных заряда, равные по абсолютной величине, образуютэлектрический диполь.В составе мембран большая часть белков взаимодействует с липидами наоснове гидрофобных связей и многие мембранные белки состоят из участков,богатыхполярными(несущимизаряд)аминокислотами,иучастков,обогащенных неполярными аминокислотами (глицином, аланином, валином,лейцином). Неполярные участки белков как бы погружены в “жирную” частьмембраны с гидрофобными участками липидов.

Полярные (гидрофильные)участки белков взаимодействуют с головками липидов и обращены в сторонуводной фазы.Наряду с морфологическими показателями, родство мембраны жировогошарикасплазматическойподтвержденорезультатамибиохимическихисследований T.W.Keenan et. al. (1970), установивших, что оболочки жировыхшариков имеют одинаковый белковый состав не только с плазматическимимембранами ткани молочной железы коров, но сходны даже с мембранамипечени крыс и отличаются лишь более высоким содержанием плазменныхлипидов.

Поэтому они, как и биологические мембраны клеток, обладаютферментативной активностью. Многими исследователями было показано, чтоместомпреимущественнойлокализацииферментовявляютсямембраныразличных форменных элементов молока, в первую очередь жировых шариков.R.M.Dowben et.

al. (1967) выявили, что эритроциты крупного рогатогоскота аглютенируются и гемолизируются антигенами, приготовленными путемиммунизациимембраныжировыхшариков.Этослужитещеоднимдоказательством того, что они являются производными клеточных мембран. Обэтом же свидетельствует обнаружение в оболочках шариков жира многих24ферментов, присущих тканевым мембранам. Кроме того, жировые шарики нерастворяются в гипотонических растворах, так как благодаря наличиюмембраны они свободно проницаемы для воды и растворов с низкоймолекулярной массой.По химическому составу мембраны жирового шарика приравнены ксамым чистым фракциям плазматической мембраны клеток молочной железы ипечени.

На белки и липиды приходится более 90 % сухих веществ мембран, втом числе содержание белка колеблется в пределах 25-60 %.Белковые компоненты мембраны по растворимости в воде делятся на 2фракции. Одна фракция структурных белков плохо растворима в воде, содержитоколо 14% азота, по аминокислотному составу отличается от белков молока(содержит меньше лизина, валина, лейцина, глютаминовой и аспарагиновойкислотибольшеаргинина).Онавключаетзначительноеколичествогликопротеидов, содержащих гексозы, гексозамины и сиаловую кислоту. Вдругую водорастворимую фракцию входят гликопротеиды с высоким (около 18%) содержанием углеводов и разнообразные ферменты (Грачев И.И., 1991).Характерными энзимами мембран, по данным Solyam A., Trams E. (1972),Janet T.Powell, Keith Brew (1977) являются ксантиноксидаза, щелочная и кислаяфосфатазы, холинэстераза, глюкозо-6-фосфатаза, S’-нуклеотидаза, (Na+ K+ Mg2+)– зависимая АТФаза.Фракционирование мембран жировых шариков центрифугированием вградиенте плотности сахарозы (Клебанов Г.

1971; Кириленко В.Н., 1989)позволило выделить 3 компонента, обозначенных как тяжелая, средняя и легкаяфракция и характеризующихся различным содержанием пептидов, липидов,углеводов и ферментов.Тяжелая фракция (плотность >1,145 г/мл) содержит 63 % протеинов, 32 %липидов и 5 % углеводов. Липиды представлены триглицеридами (40 %) ифосфолипидами (60 %), в то время как протеины состоят из 3-х основныхполипептидов (молекулярный вес 135 000, 70 000 и 53 000 D) в соотношении253:6:1. Фракция также характеризуется присутствием ксантиноксидазы и кислойфосфатазы.Средняя фракция (1,055 – 1,145 г/мл) состоит из 35 % протеинов, 58 %липидов и 6 % углеводов.

Липиды представлены триглицеридами (45 %) ифосфолипидами (55 %); причем около 70 % специфических для мембранжировых шариков фосфолипидов обнаружено именно в этой фракции.Основные полипептиды находятся в соотношении 2:4:4; высоко содержаниекислой и щелочной фосфатаз, а также 5’-нуклеотидазы.Легкая фракция (плотность < 1,055 г/мл) содержит 88 % липидов, 94 %которых приходится на триглицериды; 8 % протеинов и 4 % углеводов.

Вданной фракции не обнаружено присутствие ферментов; 70 % протеиновпредставлены полипептидами с молекулярной массой около 53 000 D.Выделенные фракции также различались по жирнокислотному составу ихтриглицеридов.По мнению В.Н.Кириленко (1989), мембраны жировых глобул содержат0,5 – 1,95 мг общих липидов в расчете на мг белкового компонента, которыесостоят из каратиноидов (0,45%), скваленоподобного компонента (0,61 %),смеси тугоплавких моно- ,ди-, триглицеридов (53- 74 %), фосфолипидов (20 – 28%) и неэтерифицированных жирных кислот (0,6 - 6,3 %).

Триглицериды,составляющие 90 % фракции глицеридов, располагаются преимущественно навнутренней поверхности мембран.Исследованиями мембран с помощью дифференциальной сканирующейкалориметрии установлено наличие шести основных температур фазовогоперехода в интервале 10 – 90 оС, что, по мнению авторов, свидетельствует обасимметрии мембранных липидов.Влитературепродолжаетсядискуссияотносительнолокализацииосновных компонентов мембран. Большинство авторов (Beri Ripla, Sharma K.C.,S.Sudarshan.,1984)считает,чтогликопротеины,5’-нуклеотидаза,фосфатидилхолин, сфинголипиды концентрируются на наружной поверхностимембраны, тогда как фосфатидилэтаноламин, фосфатидилсерин занимают26внутреннюю поверхность мембран.

Предполагается, что такое распределениефосфолипидов является характерным для плазматических мембран клетокмлекопитающих.Исследования ферментативной активности средней фракции (1,055 – 1,145г/мл) мембран жировых шариков молока показали наивысшую активность 5’нуклеотидазы и щелочной фосфатазы по сравнению с другими фракциями.Поскольку, 5’- нуклеотидаза является мембранным маркером, высокий уровеньее активности в средней фракции может свидетельствовать о максимальнойсхожести данной фракции с плазматической мембраной секреторной клетки.Колебанияплотностиматериаласреднейфракциилежатвпределах,обнаруженных в плазматической мембране молочной железы и аппаратаГольджиJanet T.Powell et al (1977) обнаружили, что мембраны жировыхшариков молока являются превосходным источником UDP – галактозы, Nацетилглюкозамина,  - 4 - галактозилтрансферазы и тиамин пирофосфатазы,являющимися маркерами аппарата Гольджи.По мнению Грачева И.И.

(1991), АТФазам, являющимся интегральнымибелками ионных насосов,принадлежит также важнейшая роль в ионномтранспорте, как элементе секреции специфических компонентов молока,осуществляемомферментнымисистемамиплазматическихмембрансекреторных клеток.1.2.1 Структура, активность и биологическая роль Na+, К +-АТФазыКак, известно химический состав внутриклеточного раствора высшихорганизмов отличается от наружной среды: внутри клетки содержится около 150ммоль·л-1 калия и 26 ммоль·л-1 натрия. В то же время, внеклеточный растворхарактеризуется высоким содержанием натрия (140 ммоль·л-1) и низким - 5ммоль·л-1- калия (Бергельсон Л.Д., 1982; Болдырев А.А., 2001).Основныепроцессыжизнедеятельностиклетки-деление,дифференцировка и рост -невозможны без присутствия одного из основных27внутриклеточных катионов –калия.

Высокое соотношение концентрации калияво вне- и внутриклеточной жидкости (38:1) поддерживается благодаря действиюNа+, К+-АТФазы, активно переносящей ионы калия в клетку, а ионы натрия - изнее (в соотношении 2:3) (вследствие активного выведения натрия из клеток Na+,K+-АТФазой 85-90% всего натрия, содержащегося в организме, находится вовнеклеточной жидкости и по этой причине определяет ее объем) (Lubin M., 1964;Adler S. et al., 1977; Smith P.L., Me Cabe R.D., 1984).Na+, K+-АТФаза- a/b-гетеродимерный интегральный белок плазматическихмембран, осуществляющий АТФ-зависимый трансмембранный перенос Na+ и К+в клетках эукариот, что обеспечивает поддержание электрохимического иосмотического градиентов одновалентных ионов, необходимых для нормальногофункционирования клеток.На внутренней поверхности мембраны она расщепляет АТФ на АДФ ифосфат, на транспортировку трех ионов натрия из клетки и одновременно двухионов калия в клетку используется энергия одной молекулы АТФ, т.

е. суммарноза один цикл из клетки удаляется один положительный заряд. Таким образом,Na/К-насосявляетсяэлектрогенным(создаетэлектрическийтокчерезмембрану), что приводит к увеличению электроотрицательности мембранногопотенциала приблизительно на 10 мВ. Транспортный белок выполняет этуоперацию с высокой скоростью: от 150 до 600 ионов натрия в секунду (БурковИ.А., 1970; Геннис Р.Б., 1997).Механизм работы Na+, K+-АТФазы описывается в рамках общей схемыE1_E2 –АТФаз (АТФаза Р-типа):E + АТФE1P + АДФ; Е1РE2P; E2PE2+ H3PO4; E2E1Согласно схеме ион Na+ (по всей вероятности, натрий внутренний)необходимы для фосфорилирования фермента.

Фосфофермент претерпеваетконформационное изменение (E1-Е2) и распадается на E2 и фосфат в присутствииионов калия (наружного). Затем E2 релаксирует в E1. Состояние E2P фиксируетсяоуабаином (Скулачев В.П., 1989).28Работами Лопиной О.Д. (1999), Павлова К.В. и др. (1999) выявлено, чтоNa+, K+-АТФаза представляет собой мембранно-связанный олигомер, состоящийизэквимолярныхколичествдвухсубъединиц:каталитическойигликозилированной . Хотя в большинстве условий Na+, K+-АТФаза выделяетсяв форме димера ()2 или ещё более высокомолекулярных комплексов, длянормальной функциональной активности достаточен комплекс .Исследованиями ряда ученых (Jorgensen P.L., 1974; Нок Т., 1973;Болдырев А.А.

и др., 1981) определены молекулярные массы субъединиц Na+,K+-АТФаза различных тканей и органов животных. Так,  субъединица почеккролика имеет молекулярную массу 112000 Д,  субъединица -45000 Д; субъединица печени крысы- 100000 Д,  субъединица - 50000 Д;  субъединицасолевых желез утки имеет массу 91000 Д,  субъединица - 63 000 Д.Вишняков С.И. (1988), Jorgensen P.L. et al. (1982) считают, что в составNa+, K+-АТФазы входит еще один белок с молекулярной массой около 10 кДа,которыйбылназван-субъединицей.Определивоколополовиныаминокислотной последовательности этого белка, Collins J.H., Leszyk K.J. (1987)смог доказать, что  - субъединица представляет собой индивидуальный белок, ане фрагмент больших субъединиц ( и ).В последние годы путём выяснения последовательности нуклеотидов всоответствующих генах (Болдырев А.А.